Host Chaperones and Glycosylation as Determinants of Orthoflavivirus Replication: Mechanistic Insights and Therapeutic Interference

Orthoflaviviren, die von Stechmücken oder Zecken übertragen werden, gehören zu den wichtigsten Arboviren für die Gesundheit von Mensch und Tier. Der Klimawandel und die globale Mobilität erweitern ihr endemisches Verbreitungsgebiet und erhöhen damit das Infektionsrisiko. Neurotrope Arten wie das durch Zecken übertragene Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV) und das durch Mücken übertragene West-Nil-Virus (WNV) können in das zentrale Nervensystem (ZNS) eindringen und schwere neurologische Erkrankungen und möglicherweise lebenslange Defizite verursachen. Zwar gibt es für einige Arten Impfstoffe, doch stehen derzeit keine spezifischen antiviralen Therapien zur Verfügung, und die Behandlung erfolgt ausschließlich symptomatisch. Orthoflaviviren nutzen das endoplasmatische Retikulum (ER) des Wirts für ihre Vermehrung, indem sie die ER-Membranen umstrukturieren und die zellulären Mechanismen der Proteinfaltung einsetzen, um die korrekte Faltung und Stabilität der viralen Proteine zu gewährleisten. Einige Orthoflavivirus-Proteine, darunter die essenziellen Glykoproteine Prä-Membranprotein (prM), Hüllprotein (E) und Nicht-Strukturprotein 1 (NS1), werden co-translational ins ER transloziert, wo sie mithilfe zellulärer Faktoren ihre dreidimensionale Struktur ausbilden, und post-translational N-glykosyliert werden, welches zu ihrer korrekten Faltung, Stabilität und Funktion beiträgt. In dieser Arbeit wurden die Interaktionen zwischen Orthoflavivirus-Glykoproteinen und den Chaperonen BiP und Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) untersucht und die Wirkung einer pharmakologischen Hemmung der Hsp70-Aktivität und der N-Glykosylierung auf die Vermehrung von Orthoflaviviren geprüft, was das Potenzial dieser Mechanismen als neuartige, wirtseigene antivirale Ziele aufzeigt.

 

Um diese Ergebnisse zu erzielen, wurden CaCo-2-Zellen mit den durch Zecken übertragenen Orthoflaviviren FSMEV und Langat-Virus (LGTV) sowie mit den durch Mücken übertragenen Orthoflaviviren WNV und Usutu-Virus (USUV) infiziert und die Interaktionen ihrer Glykoproteine mit den Chaperonen BiP und Hsp70 untersucht. Die E-Proteine aller getesteten Orthoflaviviren interagierten mit beiden Chaperonen, während sich die Interaktionen der NS1-Proteine zwischen den durch Zecken und den durch Mücken übertragenen Viren unterschieden. Die NS1-Proteine der durch Zecken übertragenen Viren FSMEV und LGTV interagierten mit beiden Chaperonen, während dies bei den durch Mücken übertragenen Viren WNV und USUV nicht der Fall war. Die funktionelle Hemmung von Hsp70 mit zwei niedermolekularen Verbindungen zeigte unterschiedliche antivirale Wirkungen. Der allosterische Inhibitor YM-1, der auf die Nukleotidbindungsdomäne (NBD) von Hsp70 wirkt, zeigte ein breites Spektrum an antiviraler Aktivität, indem er den Infektionstiter und die Freisetzung von Viruspartikeln bei allen getesteten viralen Spezies deutlich reduzierte. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte PES-Cl, welches die substratbindende Domäne (SBD) hemmt, selektiv die Sekretion der NS1-Proteine der durch Zecken übertragenen Orthoflaviviren, während durch Stechmücken übertragene Orthoflaviviren davon unbeeinflusst blieben. Diese Ergebnisse deuten auf artspezifische Unterschiede in der Abhängigkeit von Wirts-Chaperonen hin und unterstreichen die wesentliche Rolle von Chaperon-Interaktionen bei der Proteinfaltung, dem Zusammenbau von Virionen und der Proteinsekretion von Orthoflaviviren. Der siRNA-vermittelte BiP-Knockdown führte zu einer weiteren Verringerung der E- und NS1-Proteinspiegel sowohl in Zelllysaten als auch in Überständen von FSMEV- und WNV-infizierten Zellen, obwohl die Infektiosität weitgehend unbeeinflusst blieb. Während die Gründe für die unterschiedlichen Chaperon-Interaktionen zwischen den einzelnen Virusspezies noch geklärt werden müssen, besteht ein wesentlicher Unterschied zwischen dem NS1-Protein von FSMEV/LGTV und WNV/USUV in ihrem N-Glykosylierungsmuster.

 

In einer zweiten Studie wurde die Rolle der N-Glykosylierung bei der Reifung der E- und NS1-Proteine von FSMEV, LGTV, WNV und USUV unter Verwendung des Glukosidase-Inhibitors 1-Desoxynojirimycin (DNJ) als potenziellen antiviralen Wirkstoff untersucht. Die DNJ-Behandlung infizierter CaCo-2-Zellen führte zu einer deutlichen Verringerung der infektiösen Titer, der viralen RNA-Spiegel und der E- und NS1-Proteinexpression bei FSMEV und LGTV, während die von Mücken übertragenen Viren nur eine begrenzte oder gar keine Anfälligkeit zeigten. Die Proteinmengen und Virustiter blieben für WNV weitgehend unverändert, während USUV eine mäßige Verringerung der Proteinmengen ohne signifikante Auswirkungen auf die Virustiter aufwies. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die von Zecken übertragenen Orthoflaviviren empfindlicher auf Störungen der N-Glykosylierung reagieren, was ihre Bedeutung für den Zusammenbau und die Sekretion von Virionen unterstreicht.

 

Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass sowohl Wirts-Chaperon-Interaktionen als auch die N-Glykosylierung für die Produktion infektiöser Orthoflavivirus-Partikel und für die Aufrechterhaltung des viralen Lebenszyklus entscheidend sind. Generell waren die von Zecken übertragenen Orthoflaviviren stärker auf Chaperonfunktionen und Glykosylierung angewiesen, um die strukturelle Integrität ihrer viralen Proteine aufrechtzuerhalten, was darauf schließen lässt, dass die Proteinfaltung eine Schwachstelle darstellt, die ausgenutzt werden könnte. Die gezielte Beeinflussung dieser vom Wirt abhängigen Prozesse stellt eine vielversprechende Strategie für die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mit breitem Wirkungsspektrum gegen Orthoflaviviren dar.