Metabolomics and proteomics in multiple system atrophy (MSA)

Smandzich, Nadine, Jessica

Dissertation 2025 CC BY 4.0

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Metabolomics and proteomics in multiple system atrophy (MSA)

German
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In dieser Doktorarbeit wurde die neurodegenerative Erkrankung Multiple Systematrophie (MSA) anhand eines in vitro-Zellmodells untersucht, um neue Erkenntnisse über die pathologischen Mechanismen auf der zellulären Ebene zu gewinnen. Hierfür wurden humane induzierte pluripotente Stammzelllinien von MSA-Patienten mit dem Parkinson-Subtyp (MSA-P) und gesunde Kontrollzelllinien verwendet, die zu striatalen GABAergen mittelgroßen dornentragenden Projektionsneuronen (MSNs) differenziert wurden. Dieser Zelltyp macht den Großteil der Zellpopulation im Striatum aus, welches wesentlich von der Degeneration beim Parkinson-Subtyp der MSA betroffen ist. Dementsprechend wurden MSNs untersucht, ob es Veränderungen zwischen den Patientenzelllinien und den gesunden, auf Geschlecht und Alter abgestimmten Kontrollzelllinien gibt. Hierbei lag der Fokus auf die Erforschung des Metaboloms und Proteoms.

In der ungezielten Metabolomanalyse wurden in den MSNs der Patientenzelllinien verschiedene signifikante Peaks identifiziert. Um herauszufinden, welche Metabolite hinter diesen Peaks stecken könnten, wurden die entsprechenden Massen in den Metabolomdatenbanken gesucht. Hierbei wurden die Massen mit einem oder auch mehreren Metaboliten verknüpft, wobei einige Metabolite aufgrund von Fragmentierung auch in mehreren Masse-zu-Ladungs-Verhältnissen gefunden werden konnten. Anhand dieser Metabolite wurde eine Stoffwechselweganalyse durchgeführt, um mögliche betroffene Stoffwechselwege zu identifizieren. Es wurden 15 Stoffwechselwege als signifikant identifiziert, wobei die Bedeutung der Position des potenziell veränderten Metaboliten im Stoffwechselweg berücksichtigt wurde. Eines dieser Stoffwechselwege war der Citratzyklus, der aufgrund wichtiger mitochondrialer Prozesse und Energiegewinnung in der gezielten Metabolomanalyse tiefergehend analysiert wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Konzentration von Succinat in den MSNs der Patientenzelllinien signifikant verringert war. Weiterführende Untersuchungen der Enzymaktivitäten und Konzentrationen ergaben, dass die Adenosintriphosphat- (ATP-) Konzentration signifikant reduziert und das NAD⁺/NADH-Verhältnis erhöht war, obwohl sich die NAD⁺- und NADH-Konzentrationen nicht signifikant unterschieden.

In der ungezielten Proteomanalyse wurden ebenfalls signifikante Unterschiede in den Proteinintensitäten zwischen MSA-P und gesunden Kontrollzelllinien gefunden. 151 Proteine waren signifikant verändert, davon waren 25 in den MSNs der Patientenzelllinien signifikant hochreguliert und 16 signifikant herunterreguliert. Für diese 151 Proteinen wurden mithilfe bioinformatischer Tools wie PANTHER Klassifizierungssystem und Reactome-Datenbank verschiedene Kategorisierungen und Überrepräsentationsanalysen durchgeführt. Es hat sich herausgestellt, dass die Proteine in der Genexpression, in biosynthetischen und metabolischen Prozessen überrepräsentiert waren. Darüber hinaus wurden Überrepräsentationen in den Reaktionen und Interaktionen festgestellt, die den Bereichen von Zellzyklus, Zelltod, Translation, Regulation, Degradierung, zelluläre Antwort, Signalwege, axonale Wegfindung, neuronale Entwicklung und virale Infektion zugeordnet wurden.

Des Weiteren wurde untersucht, ob es mögliche vorgeschaltete regulatorische Kandidaten gibt, die die beobachteten Expressionsänderungen erklären könnten. Dabei wurden das Chaperon MKKS, das Histon H1.1, die Lysin-spezifische Demethylase 5A, die als Histondemethylase fungiert, und das Protein p53 identifiziert.

Zusammenfassend wurden verschiedene Veränderungen im Metabolom und Proteom von MSNs festgestellt, die hinsichtlich ihrer zellulären Prozesse und Funktionen vielseitig sind. Weitere Forschungsarbeiten sind erforderlich, um die entdeckten Stoffwechselwege, Metabolite und Proteine zu bestätigen und diese in Zusammenhang mit der Erkrankung mechanistisch zu analysieren. In Zukunft könnten diese Erkenntnisse zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansatzpunkte und diagnostischer Biomarker beitragen.

In this doctoral thesis, the neurodegenerative disease multiple system atrophy (MSA) was investigated using an in vitro cell model in order to gain new insights into the pathological mechanisms at the cellular level. For this purpose, human induced pluripotent stem cell lines from MSA patients with the Parkinsonian subtype (MSA-P) and healthy control cell lines were used, which were differentiated into striatal GABAergic medium spiny neurons (MSNs). This cell type comprises the majority of the cell population in the striatum, which is substantially affected by degeneration in the Parkinsonian subtype of MSA. Accordingly, MSNs were examined to determine whether there were differences between the patient cell lines and the healthy control cell lines that were matched for sex and age. This study focused on researching the metabolome and proteome.

In the untargeted metabolome analysis, various significant peaks were identified in the MSNs of the patient cell lines. To find out which metabolites could be underlying these peaks, the corresponding masses were searched for in the metabolome databases. The masses were linked to one or more metabolites, whereby some metabolites could also be found in several mass-to-charge ratios due to fragmentation. Based on these metabolites, a metabolic pathway analysis was performed to identify potentially affected metabolic pathways. 15 metabolic pathways were identified as significant, considering the importance of the position of the potentially altered metabolite in the metabolic pathway. One of these metabolic pathways was the citrate cycle, which was analysed in greater depth in the targeted metabolome analysis due to important processes in the mitochondria and energy production. The results showed that succinate concentration was significantly reduced in the MSNs of the patient cell lines. Further investigations of enzyme activities and concentrations revealed that the adenosine triphosphate (ATP) concentration was significantly decreased and the NAD⁺/NADH ratio was increased, although the NAD⁺ and NADH concentrations did not differ significantly.

In the untargeted proteome analysis, significant differences in protein intensities were also found between MSA-P and healthy control cell lines. 151 proteins were significantly altered, of which 25 were significantly upregulated and 16 were significantly downregulated in the MSNs of the patient cell lines. Various categorisations and overrepresentation analyses were performed for these 151 proteins using bioinformatics tools such as the PANTHER classification system and the Reactome database. As a result, proteins were overrepresented in gene expression, biosynthetic and metabolic processes. In addition, overrepresentations were observed in the reactions and interactions assigned to the areas of cell cycle, cell death, translation, regulation, degradation, cellular response, signalling pathways, axonal guidance, neuronal development and viral infection.

Furthermore, it was investigated whether there are any possible upstream regulatory candidates that could explain the observed expression changes. The chaperone MKKS, histone H1.1, lysine-specific demethylase 5A, which functions as histone demethylase, and the protein p53 were identified.

In summary, various changes were found in the metabolome and proteome of MSNs, which are versatile in terms of cellular processes and functions. Further research is needed to confirm the discovered metabolic pathways, metabolites and proteins and to analyse them mechanistically in the context of the disease. In the future, these findings may contribute to the development of new therapeutic targets and diagnostic biomarkers.