Sperm sexing in cattle using the TLR7/8-ligand based method in combination with swim-up compared to microfluidic sorting chips

In dieser Dissertation wird ein neuer, alternativer Ansatz zur Geschlechtsbestimmung von Rinderspermien vorgestellt, bei dem ein auf dem TLR7/8-Liganden R848 basierendes Swim-up-Verfahren (SU) mit mikrofluidischen Sortierchips (MC) kombiniert wird. Die herkömmliche Methode der Durchflusszytometrie zur Sexsortierung erreicht zwar eine hohe Genauigkeit (85-90% X-Spermien), kann jedoch die Spermienqualität aufgrund mechanischer Belastung beeinträchtigen und erfordert hohen technischen Aufwand. Aktuelle Studien zeigten, dass TLR-7/8-Rezeptoren bei Rindern ausschließlich in X-Spermien vorkommen. Durch Aktivierung dieser Rezeptoren mit R848 wird die ATP-Produktion vermindert und damit die Beweglichkeit der X-Spermien reduziert. Dies ermöglicht eine bewegungsbasierte Trennung von X- und Y-Spermien mittels SU oder MC.

Es wurden zwei Experimente durchgeführt. In Experiment 1 wurden frische, kryokonservierte und X-gesexte bovine Spermien mittels SU-Sortierung mit (Gruppe R) und ohne R848 (Kontrolle, Gruppe C) getrennt, um Motilität, Membranintegrität und Geschlechterverhältnis zu untersuchen. In Experiment 2 wurden frische und kryokonservierte bovine Spermien sowohl mit der SU- als auch mit der MC-Sortierung, jeweils mit und ohne R848, getrennt, um zu evaluieren, ob die            MC-Sortierung die Spermienmotilität, Membranintegrität und das Geschlechterverhältnis im Vergleich zur SU-Sortierung mit R848 verbessert. Unterschiede zwischen den Gruppen (Gruppe C und Gruppe R) sowie zwischen den Schichten (obere Schicht -UL und untere Schicht-LL) wurden in beiden Experimenten untersucht.

Die Ergebnisse aus Experiment 1 zeigten, dass R848 den Anteil schnell-beweglicher Spermien in Gruppe R im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe C bei frischen, kryokonservierten und geschlechtssortierten Spermien signifikant reduzierte (p<0.05). In Gruppe R war der Anteil der schnell-beweglichen Spermien sowohl in den UL als auch in den LL etwa 30–40 % niedriger als in den entsprechenden Kontrollfraktionen für frische, kryokonservierte und geschlechtssortierte Spermien (p<0,05). Im Gegenzug nahm der Anteil langsam-beweglicher Spermien in behandelten Proben über alle Konfektionierungen hinweg etwa zwei- bis vierfach zu (p<0,05). Trotz dieser deutlichen Unterschiede in der Motilität wiesen Plasmamembran-, Akrosomenmembranintegrität und mitochondriales Membranpotenzial (MMP) keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen auf (p>0,05), was darauf hinweist, dass R848 selektiv die Motilität und nicht die generelle Spermienvitalität beeinflusste.

Beim Vergleich der Spermientrennmethoden in Experiment 2 zeigte sich, dass die aus der    MC-Sortierung wiedergewonnen Proben konsistent eine höhere Motilität aufwiesen als die Proben aus der SU-Sortierung. In sowohl frischen als auch kryokonservierten Proben wiesen die UL, die durch MC-Sortierung gewonnen wurden, eine über 30 % höheren Anteil schnell-beweglicher Spermien und deutlich geringere Schädigungen der Plasma- und Akrosomenmembran im Vergleich zu den LL auf (p<0,05). Darüber hinaus führte die MC-Sortierung zu einer etwa 5–15 % höheren Motilität in den UL-Proben im Vergleich zur UL aus der SU-Sortierung (p<0,05). Die Motilitätswerte der LL waren bei MC-sortierten Proben etwa 20–30 % niedriger als bei LL-Proben aus der SU-Sortierung (p<0,05). Dieses Muster zeigte sich sowohl bei behandelten (Gruppe R) als auch unbehandelten (Gruppe C) Proben. Allerdings führte keine der Methoden zu einer signifikanten Anreicherung von X- oder Y-Chromosom-tragenden Spermien (p>0,05), was darauf hindeutet, dass weder die R848-Behandlung noch die Sortiertechnik das Geschlechterverhältnis beeinflussten.

Zusammenfassend bietet die kombinierte Anwendung von R848 und MC einen perspektivreichen alternativen Ansatz zu Geschlechtssortierung von Spermien bei Rindern. Auch wenn mit Hilfe dieser Methode keine signifikante Geschlechtsanreicherung erreicht wurde, zeigen die Ergebnisse Potenzial zur Verbesserung der Spermienqualität. Weitere Optimierungen, insbesondere hinsichtlich R848-Dosierung, Behandlungsdauer und Chipdesign, sind erforderlich, um die Eignung und Inklusion dieser Methode für die Rinderzucht und andere Tierarten abschließend zu bewerten.