Quantifizierung endogener Insulinkonzentrationen bei der Katze mit Diabetes mellitus
Etwa 80 % der diabetischen Katzen sind von einem DM betroffen, der dem Typ 2 des Menschen ähnelt, sodass bei der Diagnose oft noch intakte β-Zellen vorhanden sind und die Chance besteht, dass es zur Wiederaufnahme der Insulinproduktion nach Aufhebung der Glukotoxizität kommt. Katzen sind zu Beginn jedoch meist auf eine Therapie mit exogenen Insulinen angewiesen. Kürzlich erfolgte die Zulassung der SGLT-2 Inhibitoren Bexagliflozin und Velagliflozin für die Katze. Für einen sicheren Einsatz ist das Vorhandensein einer ausreichenden endogenen Insulinproduktion erstrebenswert, da eine Nebenwirkung der SGLT-2 Inhibitoren das Risiko für eine euglykämische, diabetische Ketoazidose ist. Die Quantifizierung der felinen Insulinproduktion könnte eine Hilfe für die Patientenselektion dieser neuen Wirkstoffklasse sein. Ein 2012 intensiv für die Katze validierter ELISA, der in wissenschaftlichen Studien der letzten Jahre oft Anwendung fand, wurde kürzlich vom Markt genommen, sodass zum Zeitpunkt dieser Studie weder für diagnostische noch für Forschungszwecke ein kommerziell verfügbarer Test etabliert ist. Da sich die Aminosäurensequenz des Insulinmoleküls zwischen den Spezies nur gering unterscheidet, können Insulintests teils Interspezies-Kreuzreaktivitäten aufweisen. Darunter versteht man, dass ein Antikörper, der eigentlich für eine bestimmte Spezies entwickelt wurde auch das Antigen anderer Spezies detektiert und daher spezies-übergreifend eingesetzt werden kann. Je nach Spezifität, zeigen Insulintests variable Kreuzreaktivitäten mit exogenen Insulinen. Diese Variabilität ist auf die teils verschiedenen Antikörper zurückzuführen, die jeweils unterschiedliche Antikörper-Bindungsstellen (Epitope) im Insulinmolekül erkennen. Entscheidend, ob ein exogenes Insulin nachgewiesen wird, ist somit, ob am oder in der Nähe von dem beteiligten Epitop eine strukturelle Differenz vorliegt. Die Kreuzreaktivität jedes exogenen Insulins in jedem Insulintest muss daher genau untersucht werden und ist nicht zwischen Tests oder Präparaten übertragbar. Untersucht wurden drei kommerziell erhältliche Immunoassays, die alle bisher nicht für felines Insulin validiert wurden: Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA (us-ELISA) (10-1132-01, Mercodia AB, Uppsala, Sweden), Mercodia Equine Insulin ELISA (eq-ELISA) (10-1205-01, Mercodia AB, Uppsala, Sweden) und Creative Diagnostics Feline Insulin ELISA (fe-ELISA) (Creative Diagnostics, New York, NY, USA). Im ersten Studienteil wurden 77 Restblutproben nüchterner Katzen in allen ELISAs gemessen. Ausgeschlossen wurden Katzen mit einem diagnostizierten Diabetes mellitus, sowie mit Insulinresistenz assoziierten Erkrankung wie Hypersomatotropismus, Hyperadrenokortizismus, Pankreatikopathien und die in den Wochen vor der Probenahme Glukokortikoide oder Progestagene erhalten hatten. Auf Grundlage der Messergebnisse wurden für jeden der untersuchten ELISAs Referenzintervalle berechnet. Geprüft wurden zudem Präzision, Genauigkeit, Verdünnungslinearität und unteres Quantifizierungslimit (LLOQ). Stabilität wurde über vier Auftauzyklen und bei Raumtemperatur über 48 Stunden untersucht. Im zweiten Studienteil wurden die Insulinpräparate ProZinc® (rekombinantes humanes Protamin-Zink-Insulin; PZI), Caninsulin® (porcines Lente-Insulin), Lantus® (Insulin glargin), Levemir® (Insulin detemir) und Huminsulin® Normal (rekombinantes humanes Normalinsulin) in felines Plasma gegeben und linear verdünnt. Die prozentuale Wiederfindung wurde als Verhältnis von gemessenem zu erwartetem Wert berechnet und der Mittelwert aller Wiederfindungen wurde zur abschließenden Bestimmung der Kreuzreaktivität gebildet. Zudem wurden Restblutproben von acht diabetischen Katzen unter verschiedenen Insulintherapien analysiert. Insgesamt konnte eine hohe Variabilität der Kreuzreaktivitäten der Insulintests festgestellt werden. Insulin glargin und Insulin detemir wiesen im humanen (2,3% und 0,3%) und equinen ELISA (13,8 und 0,0%) keine oder nur geringe Kreuzreaktivität auf, sodass die Messwerte diabetischer Katzen unter diesen Präparaten in diesen Assays (8,9-65,1 pmol/L) vermutlich endogenes Insulin widerspiegelten. Die restlichen exogenen Insuline zeigten deutliche Kreuzreaktivitäten (70,8-108,6%), sodass hier nicht zwischen exogenem und endogenem Insulin differenziert werden konnte. Der Mercodia ultrasensitive Insulin ELISA zeigte gute Validierungsergebnisse und ist aufgrund des niedrigen Quantifizierungslimits der am besten geeignete ELISA zur Bestimmung basaler feliner Insulinkonzentrationen. Damit steht nun wieder ein intensiv validierter Test zur Verfügung, der sowohl für diagnostische als auch wissenschaftliche Zwecke genutzt werden kann. Da die Tests eine erhebliche Variation der gemessenen Insulinkonzentrationen zeigten, wird die Verwendung der Test-spezifischen Referenzintervalle, die in dieser Studie zur Verfügung gestellt werden, dringend empfohlen. Zu beachten ist, dass aufgrund einer hohen Individualität zwischen Katzen, serielle Messungen der basalen Insulinkonzentration in Erwägung gezogen werden sollten. Die Stabilität von felinem Insulin in EDTA-Plasma unterstützt die praktische Einsetzbarkeit der Insulinmessung. Die Kreuzreaktivitäten der drei Insulinassays mit den untersuchten exogenen Insulinpräparaten waren sehr variabel. Aufgrund keiner oder sehr geringer Kreuzreaktivitäten, kann die Bestimmung endogener Insulinkonzentration unter der Therapie mit Insulin glargin (Lantus®) und Insulin detemir (Levemir®) im Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA und im Mercodia Equine Insulin ELISA möglich sein. Weitere Studien, auch zu einer möglichen Suppression der endogenen Insulinkonzentration unter den Präparaten, sind nötig. Die deutlichen Kreuzreaktivitäten aller drei Insulintests zu porcinem Lente-Insulin (Caninsulin®), rekombinantem humanem PZI (ProZinc®) und rekombinantem humanen Normalinsulin (Huminsulin® Normal), verhindert eine Bestimmung endogenen Insulins. Alternativen könnten die C-Peptid-Messung oder der Einsatz von Massenspektrometrie sein.
Approximately 80% of diabetic cats are affected by a type of DM similar to type 2 diabetes in humans, so that at the time of diagnosis, intact β-cells are often still present and there is a chance that insulin production may resume once glucotoxicity is resolved. However, in the beginning, cats are mostly dependent on exogenous insulin therapy. Recently, the SGLT-2 inhibitors bexagliflozin and velagliflozin were approved for cats. For safe use, the presence of sufficient endogenous insulin production is desirable, since a side effect of SGLT-2 inhibitors is the risk of euglycemic diabetic ketoacidosis. The quantification of feline insulin production could therefore support patient selection for this new drug class. An ELISA extensively validated for cats in 2012, and frequently used in scientific studies in the last years, was recently withdrawn from the market, so at the time of this study no commercially available test was established for either diagnostic or research purposes. Since the amino acid sequence of the insulin molecule differs only slightly between species, insulin assays may exhibit interspecies-interference. This means that an antibody originally developed for a specific species may also detect the antigen of other species and can therefore be applied across species. Depending on specificity, insulin tests show variable cross-reactivities with exogenous insulins. This variability is due to the different antibodies used, which recognize different antibody-binding sites (epitopes) in the insulin molecule. Whether an exogenous insulin is detected depends on whether there is a structural difference at or near the epitope involved. The cross-reactivity of each exogenous insulin in each insulin assay must therefore be investigated precisely and cannot be transferred between assays or preparations. Three commercially available immunoassays, none of which had previously been validated for feline insulin, were examined: Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA (us-ELISA) (10-1132-01, Mercodia AB, Uppsala, Sweden), Mercodia Equine Insulin ELISA (eq-ELISA) (10-1205-01, Mercodia AB, Uppsala, Sweden), and Creative Diagnostics Feline Insulin ELISA (fe-ELISA) (Creative Diagnostics, New York, NY, USA). In the first part of the study, 77 leftover samples from fasted cats were measured in all assays. Excluded were cats with diagnosed diabetes mellitus or diseases associated with insulin resistance, such as hypersomatotropism, hyperadrenocorticism, pancreatic disease, or those receiving glucocorticoids or progestagens within the weeks prior to sampling. Based on the measurement results, reference intervals were calculated for each of the assays examined. Precision, accuracy, dilution linearity, and the lower limit of quantification (LLOQ) were tested. Stability was investigated over four freeze-thaw cycles and at room temperature over 48 hours. In the second part of the study, the insulin preparations ProZinc® (recombinant human protamine zinc insulin; PZI), Caninsulin® (porcine lente insulin), Lantus® (Insulin glargine), Levemir® (Insulin detemir) und Huminsulin® Normal (regular human insulin) were added to feline plasma and diluted linearly. The percentage recovery was calculated as the ratio of measured to expected values, and the mean of all recoveries was used to determine cross-reactivity. In addition, leftover samples from eight diabetic cats under various insulin therapies were analyzed. The us-ELISA showed good precision (intra-assay CV: 14.4 % and 6.4%), accuracy (spiking-recovery: 90.0 %), and linearity (R² = 0.99, dilution recovery: 104.0 ± 10.0 %), and its quantification range was well suited to the study population (LLOQ: 0.9 pmol/L, quantifying 75/77 samples). In contrast, 44/77 samples were below the LLOQ of the eq-ELISA (13.8 pmol/L) and 51/77 below that of the fe-ELISA (8.6 pmol/L). The assays showed significant variation in the measured insulin concentrations. Feline insulin was stable for at least four freeze-thaw cycles and for 36 hours at room temperature. The Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA showed good validation results and, due to its low quantification limit, is the most suitable ELISA for determining basal feline insulin concentrations. Thus, an intensively validated assay is once again available, which can be used for both diagnostic and scientific purposes. Since the tests showed considerable variation in the measured insulin concentrations, the use of assay-specific reference intervals, which are provided in this study, is strongly recommended. It should be noted that due to high individuality between cats, serial measurements could of basal insulin concentration should be considered. The stability of feline insulin in EDTA plasma supports the practical applicability of insulin measurement. The cross-reactivities of the three insulin assays with the exogenous insulin preparations studied were highly variable. Due to no or very low cross-reactivities, the determination of endogenous insulin concentration under therapy with insulin glargine (Lantus®) and insulin detemir (Levemir®) in the Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA and the Mercodia Equine Insulin ELISA may be possible. Further studies, including the possible suppression of endogenous insulin concentration under these preparations, are needed. The marked cross-reactivities of all three insulin assays to porcine lente insulin (Caninsulin®), recombinant human PZI (ProZinc®) and regular human insulin (Huminsulin® Normal), prevent determination of endogenous insulin. Alternatives could be the quantification of C-peptide or the use of mass spectrometry.
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