Morphologic examination of upper respiratory tract epithelium with  special consideration of olfactory epithelium after SARS-CoV-2  infection

Schreiner, Tom

Dissertation 2025 CC BY 4.0

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Morphologic examination of upper respiratory tract epithelium with special consideration of olfactory epithelium after SARS-CoV-2 infection

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Das severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der Erreger von coronavirus disease 2019 (COVID-19), wurde erstmals im Dezember 2019 in Wuhan, China, beschrieben, und seine pandemische Ausbreitung hat bis Februar 2025 weltweit zu über 700 Millionen Infektionen mit über 7 Millionen Todesfällen geführt (https://data.who.int/dashboards/covid19/). SARS-CoV-2 ist ein umhülltes, positiv- und einzelsträngiges Ribonukleinsäure (RNS)-Virus. Die Virushülle ist mit spike-Proteinen bedeckt, welche jeweils wiederum aus drei identischen Proteinen bestehen und dem Virus in elektronenmikroskopischen Aufnahmen ein kronenartiges Aussehen verleihen. In den letzten zwei Jahrzehnten sind verschiedene hochpathogene humane Coronaviren aufgetaucht, darunter das severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV-1) im Jahr 2002 und das Middle-East respiratory syndrome coronavirus (MERS) im Jahr 2012, welche beide ursächlich für Atemwegserkrankungen mit potenziell tödlich verlaufendem akutem Atemnotsyndrom verantwortlich sein können. In der frühen Phase der Pandemie war eines der ersten Symptome einer Infektion mit SARS-CoV-2 ein leichter bis vollständiger, vorübergehender Verlust des Geruchs- (Anosmie) und Geschmackssinns (Ageusie). Die pathogenetischen und potenziell neuroinfektiösen Mechanismen im oberen Respirationstrakt (URT) und im Riechkolben (OB) des zentralen Nervensystems (ZNS) waren jedoch in der frühen Phase der Pandemie noch weitgehend unbekannt. Daher ist es notwendig, geeignete Tiermodelle zu finden, welche es ermöglichen die pathogenetischen Wege der durch SARS-CoV-2 ausgelösten neurologischen Symptome bei COVID-19besser zu verstehen.

Das vorliegende Projekt basiert auf der Hypothese, dass SARS-CoV-2 eine Schädigung und einen Verlust der beweglichen Zilien im respiratorischen Epithel (RE) des URT verursacht und, dass der Grad der Schädigung mit der Ausbreitung der Infektion in die Lunge korreliert. Darüber hinaus wird hypothetisiert, dass SARS-CoV-2 das olfaktorische Neuroepithel (OE) schädigt und die Infektion der dort vorhandenen sensorischen Neuronen eine aufsteigende zentralnervöse Infektion über den Riechnerven in das ZNS bei Mäusen, die den humanen angiotensin-converting-enzyme-Rezeptor 2 unter Kontrolle des Keratin-18-Promotors exprimieren (K18-hACE2-Mäuse), nicht aber bei Frettchen und Syrischen Goldhamstern, verursacht.

Um diese zwei Hypothesen zu näher zu beleuchten, wurde formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) sowie in Glutaraldehyd fixiertes Gewebe aus der Nase, der Luftröhre und dem ZNS aus voneinander unabhängigen in-vivo-Infektionsexperimenten mit SARS-CoV-2 bei Hamstern, Frettchen und K18-hACE2-Mäusen mittels Histologie, Virusimmunhistochemie und Elektronenmikroskopie näher untersucht. Die Ergebnisse erlauben eine räumlich-zeitliche Darstellung der sequenziellen Entwicklung von histologischen und elektronenmikroskopischen Läsionen sowie der Virusverteilung in der Nasenhöhle mit besonderem Schwerpunkt auf OE und RE in drei verschiedenen Tiermodellen von COVID-19.

Im RE aller drei Tiermodelle wurde nach SARS-CoV-2-Infektion eine eitrige Rhinitis mit einhergehender viraler Antigenexpression nachgewiesen. Das virale Antigen war auf das Epithel beschränkt und konnte nicht in der Lamina propria festgestellt werden. Frettchen und Hamster sind von Natur aus anfällig für eine SARS-CoV-2-Infektion und weisen klinische und pathologische Merkmale auf, die milden (bei Frettchen) und mittelschweren (bei Hamstern) Krankheitsverläufen von COVID-19 beim Menschen ähneln.

Bei intratracheal infizierten Frettchen zeigte das SARS-CoV-2-Antigen einen Tropismus für das rostrale RE im URT bei zeitgleich fehlender Entzündung und ohne Virusantigen-Nachweis im OE. Darüber hinaus weisen ältere im Vergleich zu jüngeren Frettchen erhöhte Virusreplikationsraten im URT auf. Das Vorhandensein viraler RNS im ZNS ohne Anzeichen einer Entzündung und viraler Antigene im OE und OB infizierter Frettchen während der akuten Phase der Infektion deutet jedoch darauf hin, dass eine Neuroinvasion von SARS-CoV-2 eher über einen anderen Weg als aufsteigend über den Riechnerv vermittelt wird. Frettchen stellen daher ein wertvolles Modell für Studien zur Virusübertragung und zu altersbedingten, asymptomatischen oder milden Verlaufsformen von COVID-19 beim Menschen dar. Intranasal infizierte Hamster zeigen transiente, schwere heterophile und histiozytäre Entzündungen in der Nasenhöhle mit assoziierter hochgradiger viraler Antigenexpression im RE und OE, nicht aber im ZNS einschließlich des OB. Die Mikroglia-Aktivierung im OB, die über die beobachtete Virus-clearance hinausgeht, deutet jedoch auf eine Neurovirulenz mit langanhaltenden neurologischen Folgen hin. Dies macht den Hamster zu einem interessanten Model für die Untersuchung der neurologischen Folgen bei akuten und post-akuten Fällen von COVID-19 beim Menschen. Gleichzeitig eignet sich das Modell für die Untersuchung SARS-CoV-2-induzierter Schäden im RE. Es wurde bewiesen, dass es bei SARS-CoV-2 infizierten Hamstern in der Trachea zu einer Dysregulation der epithelialen Homöostase kommt und die mukoziliäre clearance gehemmt wird, was möglicherweise den Weg für SARS-CoV-2 in die Lunge ebnet und gleichzeitig das Risiko für bakterielle Sekundärinfektionen erhöhen kann. K18-hACE2-Mäuse zeigen nach einer intranasalen SARS-CoV-2-Infektion Virusreplikation und histopathologische Läsionen im oberen und unteren Respirationstrakt. Darüber hinaus deutet der Nachweis von Virusantigen innerhalb des Riechepithels und des ZNS einschließlich des OB auf einen starken Neurotropismus, welcher mit einer potentiell letalen Enzephalitis einhergeht. Somit könnte das Modell repräsentativ für seltene schwere und letale Verläufe von humanem COVID-19 sein.

Zusammenfassend zeigen die Befunde, dass die untersuchten Modelle ein heterogenes Bild von klinischen Symptomen und histopathologischen Läsionen zeigen, mit individuellen Stärken und Schwächen als translationale Modelle für die humane COVID-19-Erkrankung. Während eine Anosmie ein vorherrschendes Symptom bei COVID-19 ist, deuten die Ergebnisse der drei untersuchten Modelle zusätzlich darauf hin, dass die Pathogenese der An- und/oder Dysosmie mit einer Entzündung und/oder einer Dysregulation der epithelialen Homöostase des URT zusammenzuhängen scheint. Die Untersuchungen ergaben, dass SARS-CoV-2 das olfaktorische System nicht als Haupteintrittsweg in das ZNS zu nutzen scheint. Die Gesamtheit der vorliegenden Befunde bekräftigt, dass die Wahl des Tiermodells in Abhängigkeit von der Forschungsfrage getroffen werden sollte und dass weitere Untersuchungen, insbesondere Langzeitexperimente in Kombination mit molekularen Analysen, erforderlich sind, um die langfristigen Folgen von COVID-19 weiter zu enthüllen.

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), the causative agent of coronavirus disease 2019 (COVID-19), was first described in December 2019 in Wuhan, China and its pandemic spread has resulted in over 700 million infections with over 7 million deaths worldwide as of February 2025 (https://data.who.int/dashboards/covid19/). SARS-CoV-2 is an enveloped, positive-sense, single-stranded RNA beta-coronavirus with a viral genome of approximately 30.000 RNA nucleotides. The viral envelope is covered with spikes each consisting of three identical proteins, which give it a crown-like appearance in electron micrographs. The last two decades have seen the emergence of highly pathogenic human coronaviruses, including severe acute respiratory syndrome coronavirus 1 (SARS-CoV-1) in 2002 and Middle-East respiratory syndrome Coronavirus (MERS) in 2012, which cause respiratory disease with potential fatal acute respiratory distress syndrome. One of the earliest common symptoms of infection with SARS-CoV-2 is a mild to complete, transient loss of sense of smell (anosmia) and taste (ageusia). However, the pathogenetic and potential neuroinfectious mechanisms in the upper respiratory tract (URT) and olfactory bulb (OB) in the central nervous system (CNS) remained elusive in the early phase of the pandemic. Therefore, suitable animal models need to be identified to further investigate the pathogenetic pathways of SARS-CoV-2 induced neurological symptoms.

This project is based on the hypothesis that that SARS-CoV-2 induces damage and loss of motile cilia in the respiratory epithelium (RE) of the URT and that the degree of damage correlates with the spread of infection to the lung. Secondly, it is assumed that SARS-CoV-2 causes damage to the olfactory neuroepithelium (OE) and that infection of sensory neurons causes spread to the CNS through the olfactory nerve in mice expressing the human angiotensin converting enzyme receptor 2 controlled by the keratin 18 promotor (K18-hACE2-mice), but not in ferrets and hamsters.

In this project, formalin-fixed paraffin-embedded and glutaraldehyde-fixed tissues from the nose, trachea and CNS from independent ancestral SARS-CoV-2 in vivo infectionexperiments in hamsters, ferrets and K18-hACE2-mice were analyzed by histology, virus immunohistochemistry and electron microscopy. The results provide a spatio-temporal assessment of the sequential development of lesions and virus distribution in the nasal cavity with special emphasis on the OE and RE in three different animal models of COVID-19.

Overall, suppurative rhinitis with associated viral antigen expression was detectable in the RE of all three models. Viral antigen was restricted to the epithelium and not present in the lamina propria. Ferrets and hamsters are naturally susceptible to SARS-CoV-2 infection and show clinical and pathological features similar to mild (in ferrets) and moderate (in hamsters) cases of COVID-19 in humans. In intratracheally infected ferrets, SARS-CoV-2 antigen showed a tropism for the RE in the URT with a lack of inflammation and antigen in the OE. In addition, aged ferrets show higher levels of viral replication in the URT compared to young ferrets. Nevertheless, the presence of viral RNA in the CNS without evidence of inflammation and viral antigen in the OE and OB of infected ferrets during the acute phase of infection suggests, that SARS-CoV-2 neurovirulence is mediated by a route other than the olfactory nerve. They therefore represent a valuable model for studies of viral transmission and age-related, asymptomatic or mild cases of COVID-19 in humans. Intranasally infected hamsters show transient severe heterophilic and histiocytic inflammation and massive amounts of viral antigen in the RE and OE, but not in the CNS including the OB. However, microglial activation in the OB beyond assumed viral clearance suggests neurovirulence by an undetermined pathway with long-lasting neurological consequences, indicating that the hamster model is suitable for further investigating neurological consequences in human acute and post-acute cases of COVID-19. Finally, the hamster represents a suitable model for SARS-CoV-2 induced damage to the RE. It was demonstrated that SARS-CoV-2 dysregulates the RE homeostasis and inhibits the mucociliary clearance, potentially paving the way for SARS-CoV-2 to the lower respiratory tract and increasing the risk of secondary bacterial infections. K18-hACE2-mice show viral replication and histopathological lesions in the upper and lower respiratory tract upon intranasal SARS-CoV-2 infection. In addition, neurotropism of the olfactory epithelium and CNS including the OB, associated with encephalitis and a fatal outcome, suggests that the model is representative of rare cases of fatal COVID-19.

The project has shown that the investigated models display a heterogeneous picture of clinical signs and histopathological lesions, with individual strengths and limitations as translational models for human COVID-19. While anosmia is a prevalent symptom in COVID-19, the three investigated models indicate, in addition, that the pathogenesis appears to be related to inflammation and/or dysregulation of the URT epithelial homeostasis. The investigations revealed that the olfactory route does not seem to be the main entry route for SARS-CoV-2 to the CNS. In summary, the project highlights that the choice of animal model should be considered in relation to the research question being addressed and that further investigations, especially long-term experiments in combination with molecular analysis, are needed to further elucidate the long-term consequences of COVID-19.