Pathological changes in neuronal and glial cells in a murine model for human GM1-gangliosidosis

Neuroglia sind heterogene Zellpopulationen, die im zentralen (ZNS), peripheren (PNS) und autonomen Nervensystem vorkommen. Während PNS-Gliazellen von Neuralleisten-Stammzellen (NCC) abstammen, haben ZNS-Gliazellen einen neuroektodermalen und mesodermalen Ursprung. Neuroglia fungieren als die ‚Hausmeister‘ des Nervensystems. Neben der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Unterstützung der neuronalen Funktion sind sie auch an den Abwehrmechanismen des Nervensystems beteiligt. Zwei besonders interessante Gliazelltypen, die beide den Neurotrophinrezeptor p75NTR exprimieren, stellen Satellitengliazellen (SGCs) des PNS und Müllerzellen (MCs) der Retina. Beide Zelltypen stehen in sehr engem räumlichen Kontakt mit benachbarten Neuronen und reagieren aktiv auf Veränderungen der Mikroumgebung oder der Neuronen. Darüber hinaus interagieren und kommunizieren sie mit anderen Glialzelltypen. Als Reaktion auf eine Schädigung des Nervensystems zeigen beide Zelltypen Reaktionen in Form von Veränderungen ihres Phänotyps sowie morphologische Veränderungen, eine Proliferation, verstärkte Kommunikation und eine Modulation der neuronalen Erregung. Interessanterweise scheinen SGCs nicht nur nützliche und schützende Eigenschaften zu besitzen, sondern sind auch an der Entstehung von Schmerz und verändertem nozizeptiven Verhalten von Neuronen beteiligt. Darüber hinaus wurde beiden Zellpopulationen ein neurogenes und/oder regeneratives, stammzellähnliches Potenzial zugeschrieben. Obwohl das meiste Wissen über SGCs aus Studien an Nagetieren stammt, und häufig nur im Zusammenhang mit pathologischen Zuständen, gibt es nur wenige Studien über SGCs von Menschen und anderen Spezies, wie z. B. Schweinen, obwohl diese ein ideales Tiermodell für translationale Ansätze darstellen könnten. Darüber hinaus sind Studien über MCs in Bezug auf Retinopathien weit verbreitet, jedoch ist wenig über ihr Verhalten im Rahmen der GM1-Gangliosidose bekannt. Vor diesem Hintergrund wurden in dieser Arbeit drei inhaltiche verbundene Studien durchgeführt. Die Hypothese der ersten Studie war, dass (1) SGCs von Schweinen ein interessantes Großtiermodell zur Untersuchung der Plastizität von SGCs darstellen. Daher werden im ersten Teil der Arbeit die phänotypischen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen nicht aktivierten SGCs von Schweinen und anderen Tierarten, insbesondere Mäusen und Hunden, aufgezeigt. Ähnlich den SGCs von Mäusen und Hunden exprimieren hohe Prozentzahlen der SGCs von Schweinen unter physiologischen Bedingungen Glutaminsynthetase (GS) und den Kaliumkanal 4.1 (Kir4.1). Daher können diese Marker als universelle Marker für die Detektion von SGCs innerhalb der DRG dienen. Die Expression des sauren Gliafaserproteins (GFAP), des Oligodendrozyten- Markers 2′,3′-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) und des Transkriptionsfaktors Sox2, einem Stammzellmarker, in SGCs von Schweinen ähnelte stark dem Expressionsprofil kaniner SGCs, aber nicht dem von Mäusen. Darüber hinaus waren Teile der SGCs von Schweinen positiv für den Mikroglia/Makrophagen Marker Iba1, ebenfalls im Gegensatz zu SGCs von Mäusen, die jedoch eine Expression für den gemeinsamen Leukozytenmarker CD45 aufweisen. Diese Ergebnisse verdeutlichen sowohl die artspezifischen Expressionsmuster als auch die gleichzeitige Vielfalt der SGC-Marker bei verschiedenen Tierarten. Das Expressionsmuster der SGCs von Schweinen war dem von Hunden sehr ähnlich und deutet darauf hin, dass SGCs von Schweinen unter physiologischen Bedingungen einen ähnlichen Phänotyp wie SGCs von Hunden aufweisen und möglicherweise ein ähnliches Reaktionsmuster im Kontext von Schädigungen zeigen. Beide Tiere stellen hochinteressante und geeignete Modelle für translationale Studien sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin dar, insbesondere im Hinblick auf chronische neuropathische Schmerzen. Basierend auf den Erkenntnissen früherer Studien über das physiologische Verhalten von SGCs in verschiedenen Spezies, und auch über Veränderungen in SGCs von homozygoten Knock-out-Mäusen (Glb1-/- Mäusen) in einem Mausmodell der GM1- Gangliosidose, konzentrierte sich der zweite Teil dieser Studie auf reaktive Veränderungen in Gliazellen der Netzhaut im gleichen Mausmodell. Die (2) Hypothese war, dass retinale MCs eine weitere interessante Gliazellpopulation darstellen, die sehr ähnliche Merkmale wie SGCs aufweist und ein vergleichbares Reaktionsmuster im Rahmen der GM1-Gangliosidose zeigt. Aktivierte MCs in Glb1-/- Mäusen zeigten eine signifikante Zunahme der GFAP-Expression bei fortschreitender Erkrankung, ähnlich wie SGC in Glb1-/- Mäusen. Dies deutet auf einen allgemeinen reaktiven Mechanismus in Form einer reaktiven Gliose hin und zeigt eine konservierte gliale Reaktion auf die neuronale GM1-Speicherung in verschiedenen Kompartimenten des Nervensystems. MCs zeigten ebenfalls eine Expression von GS, sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand. Die Anzahl von GS-positiven MCs in Glb1-/- Mäusen nahm zum Ende der Untersuchung wieder ab. Eine initiale Hochregulierung von GS in MCs steht im Zusammenhang mit der beobachteten reaktiven Gliose und geht später wahrscheinlich aufgrund einer veränderten Glutamatverteilung und eines geringeren Bedarfs an GS nach neuronaler Schädigung und dem Verlust von Neuronen zurück. Diese Ergebnisse zeigen, dass MCs während der GM1-Gangliosidose deutliche Anzeichen einer Aktivierung aufweisen und dass sowohl GFAP als auch GS zuverlässige Marker zur Erkennung reaktiver Veränderungen in der Aktivität von MCs darstellen. Ähnlich wie bei MCs wird GS in SGCs unter physiologischen Bedingungen in allen Spezies zu einem sehr hohen Prozentsatz exprimiert. Ein weiteres Zeichen für die Aktivierung von Gliazellen in der Netzhaut von Glb1-/- Mäusen war der Nachweis von Iba1 positiven Mikroglia/Makrophagen. Reaktive Iba1 positive Zellen zeigten morphologische Veränderungen die mit einer Umverteilung dieser Zellen in die inneren Netzhautschichten als Hauptort der Veränderungen einhergingen. Diese reaktiven Veränderungen ähneln denen der Mikroglia im Gehirn, von denen man annimmt, dass sich ihr zellulärer Phänotyp in Anhängigkeit von ihrem Aktivierungsstatus verändert. Ein Hinweis auf immunologische Eigenschaften, vergleichbar mit SGCs von Mäusen (CD45), fanden sich in Teilen der SGCs von Schweinen (Iba1). Dies deutet auf funktionelle Ähnlichkeiten hin, obwohl die Expression der Marker artspezifisch variieren kann. Degenerative Veränderungen in Neuronen führen zu reaktiver Gliose. Funktionelle Veränderungen im neuronalen Gewebe sind jedoch auch ein Schlüsselfaktor für die Charakterisierung von Krankheiten, insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien. Eine Methode zur Untersuchung der zellulären Funktionalität ist die zelluläre elektrophysiologische Untersuchung. Daher wurde in der dritten Studie eine spezialisierte neuronale Zellpopulation des medialen Nucleus des Trapezkörpers (MNTB) im ZNS untersucht, die ebenfalls von einer GM1-Akkumulation betroffen sind. Daher wurden MNTB-Neuronen in Glb1-/- Mäusen mithilfe von Elektrophysiologie und Elektroporation charakterisiert, einschließlich der Auswirkungen eine Substratreduktionstherapie (SRT) mittels Sinbaglustat. Mit Hilfe der Elektroporation konnte in der Studie eine Sinbaglustat-bedingte Verringerung der Vakuolisierung in Glb1-/- Mäusen unabhängig von der verwendeten Dosierung nachgewiesen werden. Die elektrophysiologische Untersuchung ergab, dass die basalen elektrophysiologischen Eigenschaften der MNTB-Neuronen nicht beeinträchtigt waren. Es wurden jedoch Veränderungen in der Wellenform des Aktionspotenzials und der zeitlichen Präzision während der hochfrequenten Stimulation der Glb1-/- -Mäuse festgestellt, die durch eine hohe Dosis von Sinbaglustat teilweise rückgängig gemacht werden konnten. Der Verlust der zeitlichen Präzision während der transienten Aktivität erreichte jedoch bei beiden Dosen ein Plateau, das näher am WT-Wert liegt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Untersuchung des Expressionsprofils in nicht aktivierten SGCs von Schweinen wertvolle Erkenntnisse über artspezifische Unterschiede innerhalb dieser Zellpopulation liefert. Das Verständnis der phänotypischen Merkmale von SGCs in situ ist entscheidend für in vitro-Studien an dieser Zellpopulation. Darüber hinaus bietet die potentielle Plastizität der SGCs vom Schwein, insbesondere aufgrund des Stammzell-ähnlichen Charakters, ein vielversprechendes Potenzial für potentiell therapeutisch genutzte Transplantationsstudien. Darüber hinaus wurden im zweiten Teil dieser Studie Aktivierungssignale in MCs im Mausmodell der GM1-Gangliosidose beschrieben, was neue Erkenntnisse über diese Zellpopulation und ihre Rolle in der Pathologie GM1- assoziierten Augenveränderungen liefert. MCs zeigen sehr ähnliche reaktive Veränderungen wie SGCs in demselben Mausmodell. Da beide Zellpopulationen Stammzellmarker exprimieren, wäre es interessant, diese Zellpopulation mit Blick auf das Gebiet der Zelltransplantationstherapie zu untersuchen. Darüber hinaus waren die MNTB-Neuronen im GM1-Mausmodell von einer intrazytoplasmatischen Akkumulation von Speichermaterial betroffen. Eine SRT mit Sinbaglustat reduzierte die Vakuolisierung und verlängerte das Überleben der MNTB-Neuronen in Glb1-/- behandelten Mäusen, unabhängig von der eingesetzten Dosis. Bezüglich der Elektrophysiologie fanden sich in den basalen Eigenschaften der Neuronen aller behandelten und unbehandelten Glb1-/- -Mäuse keine Beeinträchtigungen. Allerdings zeigte nur die mit der hohen Dosis behandelte Gruppe von Mäuse eine optimierte Wellenform des Aktionspotentials. Sowohl niedrige als auch hohe Dosen von Sinbaglustat stellten die zeitliche Präzision während einer hochfrequenten elektrischen Reizung der Zellen in transgenen Mäusen wirksam wieder her. Daher stellen die neuronalen elektrophysiologischen Eigenschaften einen interessanten Weg dar, pathophysiologische Mechanismen zu erforschen und Wege zu entwickeln, um die Auswirkungen von z.B. Speicherkrankheiten zu lindern.