Immun-endokrine Modulation an Hepatozyten in vitro : Einfluss von Interferon (τ) tau auf die Expression von IGF-Bindungsproteinen

Die periimplantative Phase der Gravidität des Rindes stellt ein kritisches Zeitfenster für die Etablierung der Trächtigkeit da und ist gleichzeitig die Graviditätsphase mit dem höchsten Anteil an Trächtigkeitsverlusten. Beim Wiederkäuer wird in der frühen Implantationsphase ein spezifisches Zytokin, Interferon τ (IFNτ), produziert, welches zum einen die Luteolyse unterbindet, zum anderen aber weitere immunologische Wirkungen aufweist. Dabei kann IFNτ autokrin, parakrin und endokrin wirken. Endokrine Effekte von zirkulierendem IFNτ wurden beispielsweise in der Leber nachgewiesen. Die Leber ist Hauptbildungsort für den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (Insulin-like Growth Factor 1/IGF-1). IGF-1 stellt hierbei das zentrale Hormon für Wachstum und Stoffwechsel dar. Es liegt im Organismus zu über 99 % gebunden an IGF-Bindungsproteine (IGFBPs) und die Acid Labile Subunit (ALS) vor, ist aber nur in seiner freien Form biologisch aktiv. Die Konzentration an freiem, also biologisch wirksamem IGF wird hauptsächlich durch die Konzentration der verschiedenen Bindungsproteine bedarfsgerecht angepasst. Zudem haben die Bindungsproteine auch weitere IGF-abhängige und IGF-unabhängige Funktionen im Organismus. Die Expression der Bindungsproteine erfolgt wie die von IGF-1 sowohl hepatisch als auch lokal in peripheren Geweben direkt am Wirkort.

In dieser Arbeit sollte spezifisch der Zusammenhang zwischen der IFNτ-Sekretion des Embryos in der periimplantativen Phase und der Regulation des hepatischen IGF-Systems untersucht werden. Ziel war es zu untersuchen, inwiefern eine Stimulation kultivierter primärer Hepatozyten mit rekombinantem bovinem IFNτ (rbIFNτ) die Expression von IGFBP-1 bis -7 und ALS als wichtige regulatorische Proteine des systemischen IGF-Systems beeinflusst.

Für die Untersuchung dieser Fragestellung wurden primäre bovine Hepatozyten kultiviert.Diese wurden aus dem Processus caudatus der Leber von Rindern gewonnen, die in der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgrund infauster Prognose euthanasiert wurden. Mittels Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusion und anschließender Zentrifugation wurden die Hepatozyten isoliert und dann zwischen zwei Kollagenschichten im Sandwichmodell für vier Tage kultiviert. An Tag vier in Kultur wurden die kultivierten Hepatozyten für eine Dauer von sechs Stunden mit rbIFNτ in den Konzentrationen 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml, 5,0 ng/ml und 10 ng/ml stimuliert. Die Kontrollgruppe wurde mit einer entsprechenden Menge Phosphat-gepufferter Salzlösung (Phosphate-buffered Saline/PBS) behandelt. Anschließend wurden die Hepatozyten und das Medium separat bis zur Analyse bei -80°C eingefroren. Mittels qRT-PCR wurde die mRNA-Expression für IGFBP-1 bis -7 und ALS in den kultivierten Zellen untersucht. Im Medium wurden mittels Western Liganden Blot (WLB) Proteine mit IGF-2-Bindungsaktivität detektiert. Zur labordiagnostischen Überprüfung der Viabilität und Funktionalität der primären bovinen Hepatozyten wurden im Medium mittels photometrischer Testverfahren die Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität und die Harnstoffkonzentration gemessen.

In den kultivierten Zellen konnte eine basale Expression von IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, IGFBP-7 und ALS nachgewiesen werden. Die Proteine IGFBP-2, IGFBP-3 und IGFBP-4 wurden zudem in das Zellkulturmedium freigesetzt, was zusätzlich zum Nachweis der mRNA-Expression auf die Synthese dieser Proteine in bovinen Hepatozyten in vitro hinweist. Die Expression von IGFBP-3 bis -6 in kultivierten bovinen Leberzellen in vitro war durch IFNτ stimulierbar. Die Regulation der IGFBP-4- und -5-Expression erfolgte dabei zusätzlich in Abhängigkeit von der eingesetzten rbIFNτ-Konzentration. Anhand dieser Ergebnisse und den Ergebnissen aus vorherigen In-vivo-Studien kann für IGFBP-3, IGFBP-4 und IGFBP-5 postuliert werden, dass IFNτ über die Stimulation der hepatozytären Expression an der Regulation der IGFBP-Konzentrationen im maternalen Organismus in der periimplantativen Phase beteiligt ist. Eine Limitation dieser Studie ist die mangelnde Identifikation der kultivierten Zellen, sodass eine Kontamination der bovinen Hepatozytenkultur mit nicht-parenchymalen Zellen (NPCs) der Leber nicht ausgeschlossen werden kann. Aus diesem Grund muss vor allem die detektierte Expression von IGFBP-3 und IGFBP-7 in den kultivierten Zellen kritisch betrachtet werden, da für diese Proteine bereits in murinen und humanen Zellkulturen eine quantitativ relevante mRNA-Expression in NPCs detektiert wurde. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine gezielte immun-endokrine Modulation am Hepatozyten durch das trächtigkeitsspezifische Zytokin IFNτ in Bezug auf IGFBPs, die entscheidend an der Regulation der freien IGF-1-Konzentration im Organismus beteiligt sind und auch direkte Effekte aufweisen.