In vitro Untersuchungen zum Einfluss von Interferon-tau sowie Östradiol und Progesteron auf die Polarisation von bovinen karunkulären Epithelzellen während der Peri-Implantationsperiode beim Rind

Böse, Katharina

DissertationAll rights reserved2025Published

In vitro Untersuchungen zum Einfluss von Interferon-tau sowie Östradiol und Progesteron auf die Polarisation von bovinen karunkulären Epithelzellen während der Peri-Implantationsperiode beim Rind

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Frühembryonale Trächtigkeitsverluste bei Milchkühen sind eine der Hauptursachen für wirtschaftliche Einbußen in Milchviehbetrieben. Besonders häufig treten die Trächtigkeitsverluste dabei vor der Implantation auf. In diesem Zeitraum finden die kritischen Prozesse für eine erfolgreiche Etablierung der Gravidität statt. Eine wichtige Rolle spielen in diesem Zusammenhang das wiederkäuerspezifische Zytokin Interferon-tau (IFN_τ), das als maternales Trächtigkeitserkennungssignal dient, sowie die ovariellen Steroidhormone Östradiol (E₂) und Progesteron (P₄). In der Literatur ist häufig beschrieben, dass es bei verschiedenen Säugetieren im Zuge der Implantation zu einer epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) bzw. einer Plasmamembrantransformation (PMT) der uterinen Epithelzellen kommt. Hierdurch erfolgt eine vorübergehende Herunterregulierung des epithelialen Zellprogrammes und damit der epithelzellspezifischen Polarisation, um eine Anheftung der normalerweise nicht-adhäsiven apikalen Zellpole von Uterus- und Trophoblastepithel zu ermöglichen.

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, diese höchst komplexen, zellulären Vorgänge in der Peri-Implantationsperiode des Rindes näher zu beleuchten.

Daher wurde der Einfluss von IFN_τ sowie der beiden Steroidhormone E₂ und P₄ auf die Expression sowie die Lokalisation ausgewählter Epithelzell- bzw. Polarisationsmarker in einem in vitro Zellkulturmodell untersucht. Hierfür kam eine etablierte Zelllinie boviner karunkulärer Epithelzellen (BCEC-1) zum Einsatz.

In der ersten Versuchsreihe erfolgte die Stimulation der BCEC mit unterschiedlichen Konzentrationen von IFN_τ (10, 100 und 1.000 ng/ml) über einen Zeitraum von 24 h. Hiernach fand die Analyse der mRNA-Expression der Zellstrukturmoleküle Ezrin (EZR) und Cytokeratin 18 (CK18) sowie der Zellverbindungsmoleküle E-Cadherin (CDH1), Occludin (OCLN) und Zonula Occludens-1 (ZO-1) mittels quantitativer Real Time-PCR (qRT-PCR) statt. Zusätzlich wurde auf Proteinebene die Expression von EZR und CDH1 im Western Blot sowie die Verteilung von EZR, CK18 und CDH1 mithilfe einer Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Als Kalibrator bzw. Kontrollgruppe dienten in allen durchgeführten Versuchen BCEC, die unter dem Einfluss von serumreduziertem Medium (SR) wuchsen.

IFN_τ-Konzentrationen von 100 und 1.000 ng/ml bewirkten in den BCEC eine signifikante und konzentrationsabhängige Hochregulierung der mRNA von EZR, CDH1, OCLN und ZO-1. Auf Proteinebene konnten dagegen keine signifikanten Expressionsveränderungen festgestellt werden. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte lediglich bei der Verteilung von EZR in den BCEC nach der Stimulation mit 100 bzw. 1.000 ng/ml IFN_τ im Vergleich zur SR-Kontrollgruppe optische Unterschiede.

In dieser Arbeit konnten keine Hinweise auf IFN_τ-induzierte Polarisationsveränderungen im Sinne einer EMT oder PMT der BCEC in Form einer Herunterregulierung epithelzellspezifischer Moleküle registriert werden. Durch die vermehrte Expression von Zellstruktur- (EZR) sowie Zellverbindungsmolekülen (CDH1, OCLN, ZO-1) kann jedoch wahrscheinlich die initiale Anheftung der Zellen zum Implantationsbeginn sowie die Formation von Zell-Zell-Verbindungen verbessert werden. Dies erleichtert die beginnende Implantation und unterstützt die Ernährung und das Wachstum des Konzeptus vor der Ausbildung einer Plazenta. Außerdem wird eine weitere Invasion des Trophoblasten in tiefere Schichten des mütterlichen endometrialen Gewebes verhindert und der Konzeptus vor dem maternalen Immunsystem geschützt.

In der zweiten Versuchsreihe fand die Stimulation der BCEC mit Steroidhormonen (E₂, P₄ und P₄+ IFN_τ) über einen Zeitraum von 48 h statt. Analog zur ersten Versuchsreihe erfolgte im Anschluss die Analyse der mRNA-Expression von EZR, CK18, CDH1, OCLN und ZO-1 via qRT-PCR. Mittels Western Blot wurde die Proteinexpression von EZR, CK18 und CDH1 untersucht, während eine Immunfluoreszenzfärbung Aufschluss über die Lokalisation dieser drei Marker gab. In der qRT-PCR sorgte lediglich E₂ für die signifikante Hochregulierung der beiden Zellstrukturmoleküle EZR und CK18. Im Western Blot wurden bezüglich der Proteinexpression keine signifikanten Ergebnisse erzielt. Auch die Immunfluoreszenzfärbung zeigte keine Unterschiede zwischen den Stimulationsgruppen und der SR-Kontrolle.

E₂ mediiert im Laufe des Sexualzyklus vor allem die Proliferation der endometrialen Epithelzellen. Eine vermehrte Expression der Zellstrukturmoleküle (EZR, CK18) unter dem Einfluss dieses Hormons könnte mit dem Aufbau von epithelialen Strukturen im Rahmen der endometrialen Umbauvorgänge zusammenhängen.

Des Weiteren fand in der vorliegenden Arbeit die Etablierung eines Co-Kultur-Modells statt, in welchem die BCEC zusammen mit stromalen, plazentaren Fibroblasten kultiviert wurden. Hierdurch soll eine parakrine Zellkommunikation, wie sie physiologischerweise in vivo stattfindet, auch in vitro ermöglicht werden. Im Vergleich zur Monokultur erfolgte hier probeweise die Analyse der mRNA-Expression von EZR, CK18 und CDH1 nach 24-stündiger Stimulation mit 100 ng/ml IFN_τ. Signifikante Ergebnisse wurden hierbei lediglich in Bezug auf die Expression von CDH1 erzielt, dessen mRNA durch IFN_τ analog zur Monokultur hochreguliert wurde. Allerdings fanden die Untersuchungen in der Co-Kultur mit einer geringeren Probenanzahl als in der Monokultur statt.

Durch die Etablierung und den erfolgreichen Einsatz des Co-Kultur-Modells aus BCEC und Fibroblasten steht für nachfolgende Versuche somit ein erweitertes in vitro Modell für die Untersuchung der zellulären Vorgänge im Endometrium während der Peri-Implantationsperiode des Rindes zur Verfügung.

Early embryonic mortality in dairy cattle is one of the major causes of economic losses in dairy farms. They often occur in a time period prior to implantation. During this time, critical processes for the successful establishment of pregnancy take place. In this context, the ruminant-specific cytokine interferon-tau (IFN_τ), which serves as the maternal pregnancy recognition signal and the ovarian steroid hormones oestradiol (E₂) and progesterone (P₄) play an important role. In the literature it is frequently described, that an epithelial-mesenchymal transition (EMT) or a plasma membrane transformation (PMT) occurs in the uterine epithelial cells during implantation in different kinds of mammals. This results in a temporary downregulation of the epithelial cell program and thus of the epithelial cell-specific polarisation to enable attachment of the usually non-adhesive apical cell poles of the uterine and trophoblast epithelium. The aim of this study was to improve the understanding of these highly complex cellular processes in the peri-implantation period in cattle.

Therefore, we examined the influence of IFN_τ as well as of the steroid hormones E₂ and P₄ on the expression and localisation of selected epithelial cell or polarisation markers in an in vitro cell culture model. An established cell line of bovine caruncular epithelial cells (BCEC-1) was used for this purpose.

In the first part of the study, BCEC were stimulated with different concentrations of IFN_τ (10, 100 and 1.000 ng/ml) over a period of 24 h. The mRNA expression of the cell structure molecules ezrin (EZR) and cytokeratin 18 (CK18) as well as the cell junction molecules E-cadherin (CDH1), occludin (OCLN) and zonula occludens-1 (ZO-1) was then analysed by quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR). In addition, the protein expression of EZR and CDH1 was examined via Western blotting while the distribution of EZR, CDH1 and CK18 was investigated using immunofluorescence staining. BCEC cultured in serum-reduced medium (SR) served as a calibrator or control group in all experiments.

IFN_τ-concentrations of 100 and 1.000 ng/ml significantly upregulated EZR-, CDH1-, OCLN- und ZO-1-mRNA in a dose dependent manner. On protein level, no significant changes in expression could be observed. The immunofluorescence staining only showed visual differences in the distribution of EZR in BCEC stimulated with 100 and 1.000 ng/ml compared to the SR control group.

In this study, no evidence of IFN_τ-induced polarisation changes indicating an EMT or PMT in BCEC through downregulation of epithelial cell-specific molecules could be detected. However, the increased expression of certain cell structure (EZR) and cell junction molecules (CDH1, OCLN, ZO-1) might improve the initial attachment of uterine and trophoblastic epithelial cells during implantation and the formation of cell-cell junctions. This facilitates the onset of implantation and supports conceptus nutrition and growth before placental formation. In addition, further invasion of the trophoblast into deeper layers of maternal endometrial tissues can be prevented and the conceptus can be protected from the maternal immune system.

In the second part of the study, BCEC were stimulated with steroid hormones (E₂, P₄ and P₄ + IFN_τ) over a period of 48 h. As in the first study, the mRNA expression of EZR, CK18, CDH1, OCLN and ZO-1 was subsequently analysed via qRT-PCR. The protein expression of EZR, CK18 and CDH1 was examined by Western blotting, while immunofluorescence staining provided information about the localisation of the same three markers. In the qRT-PCR, only E₂ led to a significant upregulation of the two cell structure molecules EZR and CK18. No significant results regarding the protein expression were obtained via Western blotting. Likewise, immunofluorescence staining did not show any differences between stimulation and control groups.

E₂ primarily mediates the proliferation of endometrial epithelial cells during the estrous cycle. An increased expression of cell structure molecules (EZR, CK18) under the influence of this hormone could be related to the formation of epithelial cell structures as part of the endometrial remodelling processes.

Furthermore, in the present study a co-culture model was established, in which the BCEC were grown together with stromal, placental fibroblasts. The aim is to enable paracrine cell communication, as it occurs physiologically in vivo also in vitro. In comparison to the previous monoculture experiments, the gene expression of EZR, CK18 and CDH1 in BCEC was analysed via qRT-PCR after cell stimulation with 100 ng/ml IFN_τ for 24 h. Significant results were only obtained regarding the mRNA expression of CDH1, which was upregulated in BCEC grown in co-cultures as well as in monocultures. However, in contrast to the monoculture experiments, here an overall smaller sample size was examined.

The establishment and successful use of the co-culture model of BCEC and fibroblasts means that an extended in vitro model is now available for future experiments to investigate cellular processes in the endometrium during the peri-implantation period in cattle.