transcriptional approach to equine endometrial fibrosisA : matrix stiffness, TGF-β1 and MFGE8 explored

zu Klampen, Elena

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A transcriptional approach to equine endometrial fibrosis : matrix stiffness, TGF-β1 and MFGE8 explored

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Die equine endometriale Fibrose ist eine mit zunehmendem Alter häufig auftretende, degenerative Veränderung der Gebärmutterschleimhaut von Stuten. Histomorphologisch kommt es zu einer periglandulären Ansammlung konzentrischer Lagen aus Myofibroblasten und extrazellulärer Matrix (EZM), wodurch die Fertilität der Stute negativ beeinflusst wird. Eine zentrale Rolle in der Pathogenese spielt der Myofibroblast, welcher durch chemische und physikalische Stimuli in der Regel aus normalen Fibroblasten hervorgeht. Dem Zytokin Transforming Growth Factor beta 1 (TGF‑β1) kommt hierbei eine Schlüsselrolle zu, da es die phänotypische Umwandlung von Fibroblasten zu Myofibroblasten vorantreibt, ebenso wie auch eine Zunahme der physikalischen Festigkeit der Umgebung. Die Myofibroblasten produzieren überschüssige EZM und tragen durch ihre Kontraktilität zu einer Freisetzung von TGF‑β1 aus der EZM bei, wodurch sie die Progression der Fibrose verantworten. Im Gegensatz dazu werden dem Signal- und Adhesionsmolekül Milk Fat Globule EGF and Factor V/VIII Domain Containing (MFGE8) in anderen fibrotischen Erkrankungen primär antifibrotische Effekte zugeschrieben. Im Kontext der equinen endometrialen Fibrose wurde MFGE8 bisher noch nicht untersucht.

Für in vitro Experimente wird gewöhnlich Zellkultur-Polystyrol benutzt, welches deutlich härter als das Endometrium ist. Um die Effekte, die mit einer Nutzung von Zellkultur- Polystyrol einhergehen, kritisch zu evaluieren sowie Hydrogele als ein alternatives Kultursubstrat zu testen, haben wir in unserer ersten Studie deren Effekte auf selektierte Fibrose relevante Gene auf transkriptioneller Ebene untersucht. Dafür wurden equine endometriale Fibroblasten entweder auf Zellkultur-Polystyrol oder auf Hydrogelen mit abnehmender Steifigkeit (25 kPa bis 2 kPa) kultiviert. Des Weiteren wurde der Effekt einer TGF‑β1 Exposition auf Transkriptionsebene im Kontext der unterschiedlich festen Kulturuntergründe untersucht. Neben den visuellen Unterschieden hinsichtlich Zelladhäsion, Morphologie und Zelldichte wurden Effekte in der basalen Genexpression und der transkriptionellen Reaktion gegenüber TGF‑β1 untersucht. Steifere Kulturuntergründe begünstigen die Expression der glatten Muskelgene TAGLN und ACTA2 sowie der Signalproteine PDGFB, CCN2 und SERPINE1. Dies war auch für die Integrin-Untereinheiten ITGAV und ITGB3 der Fall. Im Gegensatz dazu wurde die ITGB5 Integrin-Untereinheit auf steiferen Kultursubstraten niedriger exprimiert. Während TGF‑β1 die Menge der ITGB3 Transkripte unabhängig von der Steifheit des Kultursubstrates erhöhte, führte eine TGF‑β1 Exposition bei den Genen PDGFB, ITGAV und ITGB5 nur auf weicheren Untergründen zu einem Anstieg der Menge der Transkripte. Die Nutzung von Zellkultur-Polystyrol sollte daher kritisch gegenüber potenziellen Nachteilen abgewogen werden.

In unserer zweiten Studie haben wir die Rollen von TGF‑β1 und MFGE8 in der equinen endometrialen Fibrose mittels in situ Hybridisierung untersucht. Das glatte Muskelprotein TAGLN und das Signalprotein CCN2 wurden als nachgeschaltete Effektoren von TGF‑β1 ebenfalls berücksichtigt. Des Weiteren haben wir die transkriptionellen Effekte von TGF‑β1 und MFGE8 auf equine endometriale Fibroblasten, die auf Hydrogel kultiviert wurden, mittels Einzelzellsequenzierung untersucht. Die Relevanz dieser Gene in der equinen endometrialen Fibrose wurde dadurch bestätigt, dass in der in situ Hybridisierung TGFB1 schwach, aber regelmäßig exprimiert war, wobei die Areale, die TGFB1 im Überschuss exprimierten, alle ebenso auch eine erhöhte Expression von CCN2 und TAGLN aufwiesen. Die überwiegende Mehrheit der glandulären Areale die übermäßig viel MFGE8 exprimierten, wiesen tatsächlich Anzeichen einer fibrotischen Degeneration auf, was die Frage nach der Bedeutung von MFGE8 im Kontext der equinen endometrialen Fibrose aufwirft. Mittels Einzelzellsequenzierung wurde ein gewisser Grad transkriptioneller Heterogenität kultivierter equiner endometrialer Fibroblasten nachgewiesen. Eine Behandlung von Fibroblasten mit TGF‑β1 veränderte die transkriptionelle Expression von Genen, die mit der Anpassung der EZM assoziiert sind, führte zu einer Hochregulierung der Expression von Wachstumsfaktoren wie beispielsweise PDGFB und einer Herunterregulierung von Interferon-alpha-, -beta- und -gamma-Signalweg assoziierten Genen. Der Effekt von MFGE8 hingegen war subtiler und beinhaltete eine Reduktion des profibrotischen Leukemia Inhibitory Factor Gens und eine Hochregulierung von Interferon-alpha- und -beta-Signalweg-Genen in einer Subpopulation von Zellen. Eine andere Subpopulation von Zellen reagierte mit einer Hochregulation von Genen, die mit einer Aktivierung des Phosphatase und Tensin Homolog Signalweges assoziiert sind, was einen antifibrotischen Effekt von MFGE8 unterstützt.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse die vielfältigen profibrotischen Effekte von TGF‑β1 und bestätigen seine zentrale Rolle für die Progression der equinen endometrialen Fibrose. Die Effekte von TGF‑β1 sowie auch die basale Genexpression werden von der Festigkeit der Umgebung beeinflusst, was wiederum die Wichtigkeit dieses Faktors in der equinen endometrialen Fibrose hervorhebt. Außerdem konnten wir eine Rolle für MFGE8 als ein neues relevantes Protein in der equinen endometrialen Fibrose aufzeigen, wobei unsere Ergebnisse einen antifibrotischen Effekt von MFGE8 unterstützen und es zu einem interessanten Molekül für zukünftige Forschung macht.

Equine endometrial fibrosis is a common degenerative condition in aging mares. Histomorphologically, it is characterized by periglandular concentric layers of myofibroblasts and excess extracellular matrix (ECM), reducing the mare’s ability to carry a pregnancy to term. A central player in disease progression is the myofibroblast, which derives predominantly from normal fibroblasts upon activation by chemical and physical stimuli. Transforming growth factor beta 1 (TGF‑β1) is a key cytokine in promoting the phenotypic transition from fibroblast to myofibroblast along with increasing stiffness. Myofibroblasts are responsible for fibrotic progression through excessive production of ECM, their contractility, and the subsequent release of active TGF‑β1 from the ECM. In contrast, milk fat globule EGF and factor V/VIII domain containing (MFGE8), a signaling and adhesion protein, has primarily demonstrated antifibrotic effects in other fibrotic diseases. In equine endometrial fibrosis, MFGE8 has not yet been studied.

Tissue culture polystyrene (TCP) is commonly used for in vitro experiments but is considerably stiffer than the endometrium. To critically evaluate the use of TCP, and to explore hydrogels as an alternative culture substrate, we assessed the differences in transcript abundance of selected fibrosis-relevant genes in equine endometrial fibroblasts cultured on TCP and hydrogels of decreasing stiffness (25 kPa to 2 kPa) in our first study. Furthermore, the effect of TGF‑β1 exposure in the context of varying stiffness was investigated at the transcriptional level. In addition to visual differences regarding fibroblast adhesion, morphology, and cell density, effects on basal gene expression and the response to TGF‑β1 were observed. Stiffer substrates promoted the expression of the smooth muscle genes TAGLN and ACTA2 as well as the signaling proteins PDGFB, CCN2, and SERPINE1. This phenomenon was also observed for the integrin receptor subunits ITGAV and ITGB3. However, the ITGB5 subunit was expressed at lower levels on stiffer substrates. While TGF‑β1 increased the transcript abundance of ITGB3 regardless of substrate stiffness, TGF‑β1 exposure only led to an increase in the transcript levels of PDGFB, ITGAV, and ITGB5 on softer substrates. Therefore, the use of TCP should be critically reconsidered.

In our second study, we investigated the role of TGF‑β1 and MFGE8 in equine endometrial fibrosis using in situ hybridization, assessing their expression along with that of the smooth muscle protein TAGLN and the signaling protein CCN2 as downstream effectors of TGF‑β1 among others. We further explored the transcriptional effects of TGF‑β1 and MFGE8 by single cell sequencing of equine endometrial fibroblast cultured on hydrogels. The relevance of these genes in equine endometrial fibrosis was confirmed as TGFB1 was weakly but regularly expressed, with fibrotic areas overexpressing TGFB1, all exhibiting increased CCN2 and TAGLN expression by in situ hybridization. The vast majority of MFGE8-overexpressing glandular areas were indeed affected by fibrosis, raising the question of its effects in the context of endometrial fibrosis. Cultured fibroblasts exhibit a certain degree of heterogeneity as revealed by single cell sequencing. Treatment of fibroblasts with TGF‑β1 altered the expression of transcripts associated with extracellular matrix remodeling, upregulated growth factors such as PDGFB, and downregulated interferon-alpha, -beta, and -gamma signaling. The effect of MFGE8 was subtler and included a reduction in profibrotic leukemia inhibitory factor and upregulation of interferon-alpha and -beta signaling in a subset of cells. Another subpopulation of cells responded with an upregulation of phosphatase and tensin homolog signaling, indicating an antifibrotic effect of MFGE8.

Collectively, these results demonstrate the multiple profibrotic effects of TGF‑β1 and reaffirm its important role in the progression of equine endometrial fibrosis. Physical properties affected the basal gene expression and the response to TGF‑β1 in endometrial fibroblasts, highlighting the importance of stiffness when investigating equine endometrial fibrosis. We also discovered MFGE8 as a novel player in equine endometrial fibrosis, with our results supporting an antifibrotic effect of MFGE8, making it an interesting target for future research.