Dissecting the influence of in vitro production in bovine embryo development through single cell sequencing

Assistierte Reproduktionstechnologien (ART) haben sowohl in der humanen als auch in der bovinen Reproduktionsmedizin erhebliche Bedeutung gewonnen, insbesondere die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen. Trotz der Fortschritte sind IVP-Verfahren noch mit bestimmten Einschränkungen verbunden. Einzelzellsequenzierung (scRNA-seq) hat unser Verständnis der Genexpression auf Einzelzellebene revolutioniert. Diese mächtige Methode bietet eine einzigartige Gelegenheit, die Auswirkungen von IVP auf die embryonale Entwicklung in bisher unerreichter Detailtiefe zu untersuchen. Diese Dissertation basiert auf drei Manuskripten, die den Einfluss von IVP auf die Genexpressionsmuster in der embryonalen Entwicklung des Rindes untersuchen. Primär wurde scRNA-seq verwendet, um die Auswirkungen von IVP auf die Genexpression in der embryonalen Entwicklung des Rindes zu erforschen. Im ersten Manuskript wurden die Genexpressionsprofile einzelner Zellen aus einem gastrulierenden Rinderembryo und einem menschlichen Embryo sowie Zellen aus bovinem Trophoblasten und zwei menschlichen Trophoblasten mittels Einzelzellsequenzierung miteinander verglichen. Die integrative Analyse offenbarte eine bemerkenswerte Übereinstimmung der Genexpressionsprofile über verschiedene Zelltypen hinweg im gastrulierenden Embryo von Rindern und Menschen. Die beobachtete Übereinstimmung wurde durch das Vorkommen zentraler menschlicher Gene in bovinem Endoderm, Mesoderm, primordialen Keimzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen zusätzlich untermauert. Die Expression von für die Entwicklung der menschlichen Plazenta entscheidenden Genen, wie RUM1, GCM1, CITED1 und CITED2, konnte auch in bovinen Trophoblastzellen nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass bovine Trophoblastzellen, insbesondere jene der Cluster 14/15, den spezialisierten Zellen der menschlichen Plazenta (Synzytiotrophoblast und Zytotrophoblast) ähneln. Diese Ergebnisse weisen nachdrücklich darauf hin, dass das Rind ein wertvolles Tiermodell für die Erforschung der menschlichen Gastrulation und Trophoblastenfunktion darstellt. Im zweiten Manuskript wurde das Rauschen, das mit kleinen Stichprobengrößen in Transkriptomik-Experimenten verbunden ist, adressiert. Um diese Einschränkung zu begegnen, wurde eine Meta-Analyse von öffentlich verfügbarer Datensätze durchgeführt, die sowohl in vivo als auch in vitro erzeugte Blastozysten umfasste. Ziel dieses Ansatzes war es, die Aussagekraft der Ergebnisse zu erhöhen und robustere Schlussfolgerungen über die Auswirkungen von IVP zu ziehen. Trotz geringer Uberschneidungen den verschiedenen Studien zeigten in vitro produzierte Blastozysten eine Hochregulation von Genen des Cholesterinstoffwechsels, wie CYP51A1 und FADS1. Diese Gene könnten möglicherweise für den höheren Lipidgehalt in in vitro produzierten Blastozysten verantwortlich sein. Andererseits könnte die Herunterregulation von Trophoblastenmarkergenen wie TKDP1, KRT19 und KRT18 teilweise erklären, warum in vitro produzierte Blastozysten eine geringere Blastozystenrate, Qualität und Entwicklungskompetenz aufweisen. Darüber hinaus deuteten angereicherte Signalwege, die mit Translation, RNA-Prozessierung, und Energie-Stoffwechsel in in vitro produzierten Blastozysten assoziiert sind, auf einen kompensatorischen Reaktionsmechanismus als Antwort auf suboptimale Kulturbedingungen hin. Das dritte Manuskript verglich die embryonale Entwicklung von in vitro produzierten und durch künstliche Besamung gewonnenen Konzepten auf Einzelzellebene, um die Auswirkungen von IVP zu evaluieren. Die Clusteranalyse ergab 16 Cluster im gastrulierenden embryonalen Keimscheibe und 15 Cluster im Trophoblasten. Die aus dem gastrulierenden embryonalen Keimscheibe und dem Trophoblasten identifizierten Zellcluster wurden annotiert und anschließend einer Differenzialgenexpressionsanalyse und einer Pathway-Enrichment-Analyse unterzogen. Differenzielle Genexpression von IFN-tau-c1 in einer Teilmenge der Trophoblasten-Cluster sowie die Anreicherung von Signalwegen wie dem HOTAIR-Signalweg und Rho GTPasen im (extra-)embryonalen Mesoderm könnten einen erheblichen Einfluss auf Implantation und Plazentation haben. Darüber hinaus wurde eine geringe Anzahl an differenziell exprimierten Genen beobachtet, was auf eine insgesamt “korrektive” Wirkung der uterinen Umgebung hindeutet. Zusammenfassend haben die Ergebnisse dieser kumulativen Dissertation unser Verständnis der Auswirkungen von IVP auf die Genexpression in Rinderembryonen erweitert.