ANTiGoNE : The role of Anti-RVFV immunity in germline infection in mosquitoes

Die globale Bedrohung durch Epidemien, die von Arboviren verursacht werden, nimmt zu, da sich die klimatischen Bedingungen für ihre Vektoren kontinuierlich verbessern und sich geografische Faktoren zu ihren Gunsten verändern. Dies zeigt sich eindrucksvoll durch die Ausbreitung der asiatischen Tigermücke Aedes albopictus (Ae. albopictus) in Europa sowie die Ausbreitung des Rifttalfieber-Virus (RVFV) in Gebieten, die bisher nicht von Epidemien betroffen waren. Infektionen mit Arboviren werden häufig mit schweren Erkrankungen bei Säugetieren in Verbindung gebracht, darunter hämorrhagisches Fieber und Fehlgeburten. Ein Beispiel hierfür sind Infektionen mit dem Dengue-Virus (DENV) und dem RVFV. Aufgrund ihres blutfressenden Verhaltens spielen Stechmückenvektoren eine zentrale Rolle bei der Verbreitung dieser Arboviren. Derzeit wird angenommen, dass RVFV unter klimatisch ungünstigen Bedingungen durch vertikale Übertragung in der Vektorpopulation zirkulieren kann. Jedoch ist der volle Umfang der Übertragungswege nach wie vor kaum bekannt. RVFV, dessen Hauptvektoren Aedes spp. und Culex spp. zugehörige Stechmücken sind, steht im Verdacht, transovariell übertragbar zu sein, wie es in Experimenten an Ratten demonstriert wurde, bei denen eine direkte Infektion im Plazentagewebe der Tiere erfolgte. Derzeit stehen nur begrenzte Kenntnisse die vertikale Übertragung von RVFV betreffen zur Verfügung, insbesondere im Mückenvektor. Bei Culex tarsialis (Cx. tarsialis) Mücken konnte eine transovarielle Übertragung von RVFV bei 2-10 Prozent (%) der Nachkommen beobachtet werden, wobei lediglich sehr niedrige Virustiter nachweisbar waren. Bisher existieren keine Feldstudien zur vertikalen Übertragung von RVFV in Culex spp. Mücken. Die Interaktion zwischen dem Immunsystem des Vektors und dem Virus spielt eine zentrale Rolle im Prozess der Virusübertragung und hat einen erheblichen Einfluss auf die weitere Verbreitung dieser Viren. Die Kenntnis dieser Wechselwirkungen ist von größter Bedeutung, um die Übertragungswege einzuschätzen, das Infektionsrisiko für Mensch und Tier zu minimieren und damit den wirtschaftlichen Schaden zu verringern. Der Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi), der in drei Immunwege unterteilt werden kann – die Mikro-(mi)RNA, die kleine interferierende (si)RNA und die PIWI-interagierende (pi)RNA–, spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Arbovirusinfektion in Stechmücken. Jedoch ist wenig über die Rolle des siRNA- und piRNA-Wegs in Keimbahngeweben von Aedes aegypti (Ae. aegypti) und Culex quinquefasciatus (Cx. quinquefasciatus) Mücken nach einer RVFV-Infektion bekannt. Insbesondere das Schlüsselenzym Dicer-2 (Dcr-2) spielt eine zentrale Rolle bei der Virusabwehr in somatischen Geweben der Stechmücken. Es produziert über den exogenen siRNA (exo-siRNA)- Weg aus langen viralen Doppelstrang (ds) RNA-Vorläufern typischerweise 21 Nukleotid (nt) lange virale siRNAs (vsiRNAs), die unter der Beteiligung des siRNA-induzierenden Silencing-Komplexes (RISC) auf Argonaute-2 (Ago-2) geladen werden, was zur Unterdrückung der Virusreplikation führt. Der piRNA-Weg ist vor allem für die Transposonkontrolle in Keimbahnzellen von Bedeutung. Neue Erkenntnisse stützen jedoch die Hypothese, dass dieser Signalweg an der Virusabwehr beteiligt sein könnte. In der vorliegenden Studie wird die Expression von siRNAs und piRNAs im Körper- und Ovarialgewebe von Cx. quinquefasciatus und Ae. aegypti Mücken nach Injektion von RVFV oder langen dsRNA- Fragmenten, die von den RVFV S- bzw. M-Segmenten stammen, verglichen. Mittels Sequenzierung von kleinen RNAs-Fraktionen wurden mögliche Unterschiede zwischen diesen Signalwegen und artspezifische Unterschiede analysiert. Des Weiteren wurde die antivirale Aktivität von Dcr-2 mit Mutationen in den funktionellen Helikase-, PIWI-Argonaute-Zwille (PAZ)- und RNase-III-Domänen gegen RVFV in Ae. aegypti-Dcr-2-defizienten Zellen (Aag2-AF319) untersucht. Die Studie zeigte, dass Mutationen in allen drei Dcr-2-Domänen (Helikase (GR, KN), PAZ (M1, M3) und RNAse-III (mtR3) zu einem Verlust der Antiviralität nach RVFV-Infektion in Aag2-AF319 Zellen führen. Dennoch wurden Unterschiede in der antiviralen Aktivität zwischen den Helikase-Mutanten (GR und KN) festgestellt. Die GR-Mutante zeigte eine bemerkenswerte Verringerung der antiviralen Aktivität, während die KN-Mutante ihre Fähigkeit, antivirale Wirkungen gegen RVFV auszuüben, beibehielt. Außerdem wurde beobachtet, dass die Injektion von RVFV und RVFV dsRNA zu einer unterschiedlichen Produktion kleiner RNA in Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus Mücken führt. Es scheint artspezifische Unterschiede in der Produktion kleiner RNAs zwischen Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus Mücken zu geben. Die Transfektion von RVFV dsRNA in Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus Mücken führt überwiegend zur Bildung von 21 nt-langen, virus-abgeleiteten siRNAs (vsiRNAs), die durch Dcr-2 generiert werden. Sekundäre virus-abgeleitete piRNAs (vpiRNAs) konnten hingegen nicht nachgewiesen werden. Es wurde kein schlüssiger Beweis für eine Verbindung zwischen den siRNA- und piRNA-Immunwegen gefunden. Eine detaillierte Analyse der RNA nach einer RVFV-Infektion in Ae. aegypti (Körper) und Cx. quinquefasciatus (Körper und Ovarien) zeigte überraschenderweise nur für das RVFV S-Segment die charakteristischen Überlappungsbereiche von 2-3 nt und 18-20 nt für die 21 nt vsiRNAs. Im Gegensatz dazu wurden für das RVFV M-Segment bei den Überlappungsbereichen von 18-20 nt negative Z-Werte festgestellt. Eine RVFV-Infektion führte in beiden Mückenspezies zur Produktion von vpiRNAs mit der klassischen „Ping-Pong“-Signatur, wobei diese bei Cx. quinquefasciatus deutlich schwächer ausgeprägt war als bei Ae. aegypti.