Distribution, Expression Pattern and the Impact of Low Pathogenic Avian Influenza A Virus on the Regulation of Cellular Importin-α Isoforms in Chickens, Turkeys and Ducks

Herbst, Alexandra

Dissertation 2025 CC BY-NC 4.0

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Distribution, Expression Pattern and the Impact of Low Pathogenic Avian Influenza A Virus on the Regulation of Cellular Importin-α Isoforms in Chickens, Turkeys and Ducks

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Importin-α Isoformen werden als multifunktionale Adapterproteine beschrieben, welche neben einigen Funktionen wie z.B. in der Tumorgenese, der Muskelregeneration und der Fortpflanzung vor allem durch ihre Rolle in der zellulären Transportmaschinerie bekannt sind. Diese wird von verschiedenen Viren genutzt, um die Immunantwort des Wirtes zu umgehen, in den Zellkern einzudringen und sich hier effizient zu replizieren. Während Importin-α Isoformen in verschiedenen Spezies wie Drosophila melanogaster, Maus und Mensch bereits intensiv erforscht sind, fehlt das Wissen über die Verteilung und Expressionmuster sowie mögliche Funktionen und Rollen von Importin-α bei der Infektion mit Pathogenen in Vogelspezies.

Atemwegsinfektionen gehören zu den häufigsten Erkrankungen beim Nutzgeflügel, besonders bei Hühnern und Puten. Einer der ursächlichen Krankheitserreger ist das aviäre Influenza A Virus, welches in hochpathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) und niedrigpathogene aviäre Influenzaviren (LPAIV) unterteilt werden kann. Erkrankungen mit Influenza A Viren führen in der kommerziellen Nutzgeflügelhaltung auch heute noch weltweit zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Einige Importin-α Isoformen spielen eine entscheidende Rolle bei Influenza Virus Infektionen, besonders bei der Übertragung dieser von Vögeln auf den Menschen. Die Studienlage zur Verteilung, zum Expressionsmuster und zum Einfluss von LPAIV Infektionen auf die Regulation von Importin-α Isoformen bei Geflügelspezies, ist heute noch relativ schlecht.

Ziel unserer Studie war es, diese Wissenslücken zu schließen. Dafür gab es folgende Versuchsansätze: Gewebe der Conchen, Trachea, Lunge, Leber und Milz von Hühnern, Puten und Enten wurde entnommen um die Verteilung und die Expressionsmuster ausgewählter Importin-α Isoformen (Importin-α1, -α3, -α4, -α5 und -α6) durch RT-qPCR zu bestimmen. Zusätzlich wurden zwei verschiedene Altersgruppen jeder Geflügelspezies ausgewählt (Embryonen, einen Tag vor Schlupf und 42 Tage alte Hühner und Enten, sowie 13 Wochen alte Puten) um mögliche altersbedingte Unterschiede zu ermitteln. Darüber hinaus wurden Conchen, Trachea und Lunge von Hühnern im Alter von 42 Tagen immunhistochemisch auf die Verteilung von Importin-α1, -α3 und -α4 im Gewebe untersucht (Manuskript I).

Die höchsten mRNA-Expressionslevel wurden in allen drei untersuchte Geflügelspezies bei Importin-α3 identifiziert. Importin-α1 zeigte die zweithöchsten mRNA-Expressionslevel. Verglich man die jeweiligen Importin-α Isoformen zwischen den verschiedenen Geflügelspezies, so wiesen Enten in der Tendenz die höchsten und Puten die niedrigsten Importin-α Expressionslevel auf. Darüber hinaus wurden alle untersuchten Isoformen als Gradient im Atemtrakt des Geflügels mit niedrigstem Level in den Conchen und höchstem in der Lunge detektiert. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression aller untersuchten Importin-α Isoformen bei 42 Tage alten Hühnern höher ist als in den jeweiligen Embryonen (p < 0.05). Außer für Importin-α5, konnten diese Ergebnisse in 13 Wochen alten Puten im Vergleich mit den Embryonen ebenfalls bestätigt werden. Im Gegensatz dazu wurden in Entenembryonen höhere Importin-α mRNA-Expressionslevel gemessen als in den entsprechenden 42 Tagen alten Enten. Weiterführende Untersuchungen sind notwendig um den Einfluss der unterschiedlichen Importin-α Expressionen auf die Zellfunktionen sowie die Empfänglichkeit und Pathogenese von Infektionserregern zu verstehen.

Der zweite Arbeitsauftrag bestand darin, den Einfluss einer LPAIV Infektion auf das Expressionsmuster ausgewählter Importin-α Isoformen in zwei verschiedenen Infektionsmodellen zu untersuchen. Es wurden die mRNA-Expressionsmuster der Importine -α1 und -α3 nach LPAIV Infektion von Trachealringkulturen (TOC) und in embryonierten Eiern von Hühnern, Puten und Enten in der RT-qPCR verglichen. Zusätzlich wurde der Einfluss von zwei unterschiedlichen Virusstämmen (H6N8 A/turkey/Germany/CP6/2007 und H9N2 A/chicken/Saudi Arabia/CP7/1998) auf die Regulation und Expression von Importin-α Isoformen erfasst (Manuskript II).

Es konnte bis 24 Stunden nach der Infektion in den Trachealringkulturen aller drei Geflügelspezies ein Anstieg der Viruslevel beider LPAIV in der RT-qPCR detektiert werden. Anschließend zeigte sich ein Plateau mit leichtem Abfall bis 96 nach Infektion. Eine signifikante Hochregulation der mRNA-Expressionslevel zeigte sich in TOCs von Puten 72 und 96 Stunden nach der Infektion mit H9N2 für Importin-α1, sowie nach 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion mit H6N8 sowie mit H9N2 für Importin-α3 (p < 0.05). Eine signifikante Hochregulation der Expressionslevel von Importin-α1 zeigte sich ebenfalls in TOCs von Enten 24 Stunden nach Infektion mit H9N2 (p < 0.05). Die Ergebnisse der Infektionsstudie in embryonierten Eiern zeigten spezies-abhängige Unterschiede in der Virusreplikation, die weiterhin auch durch den Virusstamm beeinflusst waren. In der Tendenz waren die Viruslevel bei Hühnern am höchsten und bei Enten am niedrigsten. Der Zeitpunkt, der aufgrund der Datenlage in TOC selektiert wurde (24 Stunden nach der Infektion), zeigte jedoch keinen Unterschied in den Importin-α1 und -α3 Expressionsmustern im Vergleich zu den Virus-negativen Kontrollen. Möglicherweise ist im komplexen Gesamtorganismus der Verlauf der Infektion abweichend zu den TOCs, weshalb zukünftig noch weitere Zeitpunkte nach der Infektion untersucht werden müssen.

Insgesamt zeigen beide Studien deutlich, dass in der Klasse der Aves die Importin-α Expressionen in Bezug auf Spezies, Alter und Gewebe variieren, was entscheidend die Empfänglichkeit für verschiedene Erreger, insbesondere Viren, erklären kann. Die LPAIV Studien geben erste Hinweise, dass die Importin-α Expressionsmuster auch zwischen unterschiedlichen Stämmen der AIV variieren können. Weitere Studien müssen sich anschließen, um den Einfluss dieser unterschiedlichen Regulationen der Importin-α Expression auf den Infektionsverlauf in verschiedenen Geflügelspezies zu verstehen.

Importin-α isoforms are characterized as multifunctional adaptor proteins, which possess, among other functions such as roles in tumorigenesis, muscle repair and fertility, an important role in the cellular nuclear import machinery. This function is utilized by various viruses to circumvent the host’s immune response, entering the nucleus and replicating efficiently. While importin-α isoforms are well studied in several species such as Drosophila melanogaster, mouse and human, the knowledge about the distribution and expression pattern as well as functions and roles of importin-α in the infection with pathogens is still lacking in avian species.

Respiratory diseases are one of the predominant diseases in commercial poultry species, especially in chickens and turkeys. One of the causing pathogens is avian Influenza A Virus (AIV) which can be divided into Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses (HPAIV) and Low Pathogenic Avian Influenza Viruses (LPAIV). AIV infections in commercial poultry flocks still cause high economic losses worldwide. Some importin-α isoforms are suggested to play a crucial role in Influenza Virus infection, especially in transmission from birds to humans. The role of importin-α in this process has to be elucidated further.

Therefore, the aim of this study was to close these gaps. Tissues of nasal conchae, trachea, lung, liver and spleen from chickens, turkeys and ducks were collected to determine the distribution and the mRNA expression pattern of selected importin-α isoforms (importin-α1, -α3, -α4, -α5 and -α7) via RT-qPCR. Additionally, two different age groups of each poultry species were chosen (embryos, one day before hatch and 42 days old chickens and ducks, as well as 13 weeks old turkeys) to investigate possible age-related differences. Furthermore, tissues of nasal conchae, trachea and lung were used for immunohistochemical staining to show the distribution of importin-α1, -α3 und -α4 in 42-day old chickens (Manuscript I).

Importin-α3 was by far the most abundant isoform in all three investigated poultry species; Importin-α1 was identified as the second most abundant one. We saw the tendency that the expression levels in ducks were the highest in contrary to turkeys, which showed the lowest levels. Moreover, importin-α isoforms were expressed as a gradient in the avian respiratory tract with lowest levels in the nasal conchae and highest levels in the lung. In addition, we determined that the mRNA expression levels of all investigated isoforms were higher in 42 days old chickens than in corresponding embryos (p < 0.05). We were able to confirm these results in turkeys, except for the expression levels of importin-α5, which were higher in turkey embryos than in corresponding post-hatch birds. In ducks, the opposite was observed with higher importin-α mRNA expression in embryos compared to post-hatch birds. Further studies are needed to understand the impact of differential expression of importin-α in avian species on cell functions as well as variable susceptibility for and pathogenesis of infectious agents.

The second aim of this study was to describe the impact of LPAIV infection on the expression pattern of importin-α in two different infection models. We compared the mRNA expression pattern of importin-α1- and –α3 in tracheal organ cultures (TOC) and embryonated eggs of chickens (CE), turkeys (TE) and ducks (DE) via RT-qPCR after LPAIV infection. Additionally, we investigated the impact of two different virus strains (H6N8 A/turkey/Germany/CP6/2007 and H9N2 A/chicken/Saudi Arabia/CP7/1998) in these models (Manuscript II).

The virus levels of both LPAIV strains increased until 24 hours post infection (hpi) in TOCs of all three poultry species, which was confirmed by RT-qPCR followed by a subsequent shallow decrease until 96 hpi. TuTOCs showed a significant upregulation of importin-α1 72 and 96 hpi with subtype H9N2 and additionally an upregulation of importin-α3 48, 72 and 96 hpi with subtype H6N8 as well as subtype H9N2 (p < 0.05). Our findings also demonstrated significant upregulation of importin-α1 in DuTOCs 24 hpi with subtype H9N2 (p < 0.05). The results of the infection studies in embryonated eggs demonstrated species-related differences in virus replication, which were also influenced by the virus strain. Virus levels tended to be highest in chickens and lowest in ducks. However, the time point of 24hpi, which was selected based on the data obtained in TOC studies, showed no differences in the expression pattern of importin-α1 and -α3 compared to the virus negative-controls. It is possible that the course of infection in the complex entire organism differs from the infection in TOCs, and the time point was not suitable to detect differences between infected and virus-free groups. Therefore, further studies are needed to investigate this aspect more closely.

Overall, both studies highlight that the expression pattern of importin-α varies, with regard to species, age and tissue, among the class of Aves. This might be a reason for different susceptibilities towards different pathogens, especially for viruses. These studies provide basic information on the variation of the importin-α expression pattern between different AIV strains; possible modes of interaction and consequences for the virus infection have to be elucidated further.