Untersuchung molekularer Reaktionen cochleärer Zelltypen auf Implantat-assoziierte Platinkorrosionsprodukte

Berger, Elisabeth

Dissertation 2024 CC BY 4.0

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Untersuchung molekularer Reaktionen cochleärer Zelltypen auf Implantat-assoziierte Platinkorrosionsprodukte

German
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Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit war die erstmalige Charakterisierung der potenziellen Zytotoxizität von Cochlea-Implantat (CI)-assoziierten Platin (Pt)-Korrosionsprodukten auf spezifische Zellen und Gewebe der Cochlea. Untersucht wurden kommerziell hergestellte, mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) stabilisierte Platin-Nanopartikel (Pt-NP_PVP) und eine Pt(IV)-Verbindung (Natriumhexachloroplatinat (IV), Na₂(PtCl₆)), die nicht zur Klasse der antineoplastischen Medikamente gehört. Als Innenohrzellen wurden die immortalisierte Zelllinie des Corti-Organs der Maus (HEI-OC1) sowie primäre Spiralganglienzellen (SGZ) und eine organotypische Kultivierung von Explantaten des Corti Organs (OC_ex) der neonatalen Ratte verwendet.

In der ersten Studie (Berger et al., 2023) wurden HEI-OC1-Zellen und primäre SGZ als Zellkulturmodelle herangezogen, um die Auswirkungen von Pt-NP_PVP auf den Zellmetabolismus, das neuronale Überleben und das Neuritenwachstum zu untersuchen. Die HEI-OC1-Zellen wurden für 48 h mit 50-150 µg/ml Pt-NP_PVP behandelt. Die Untersuchungen zeigten weder eine Abnahme der metabolischen Aktivität noch eine Reduktion der vitalen Zellen mittels Lebendzellfärbung mit Calcein AM/Ethidium Homodimer III (EthD). Auch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte keine Beeinträchtigung der Zellen, es wurden keine Pt-NP_PVP auf der Zelloberfläche oder im Zytosol der HEI-OC1-Zellen gefunden. Primäre SGZ wurden für 48 h mit 20-100 µg/ml Pt-NP_PVP exponiert und die Überlebensrate und das Neuritenwachstum unabhängig vom nicht-neuronalen Anteil der SGZ nach antigen-spezifischer Färbung des Neurofilaments analysiert. Selbst bei der höchsten Pt-NP_PVP-Konzentration konnte keine Verminderung der Überlebensrate oder des Neuritenwachstums festgestellt werden. Zur Untersuchung der Zellmorphologie und des Wachstumsverhaltens des nicht-neuronalen Anteils der SGZ wurde die Inkubationszeit zusätzlich auf 72 bzw. 96 h verlängert. Unabhängig von der Kultivierungsdauer zeigte der Nachweis der Expression spezifischer Epitope auf Gliazellen und Fibroblasten mit Anti-Vimentin- und Anti-p75-Antikörpern eine normale Zellmorphologie und ein physiologisches Zellwachstum. Die erhobenen Daten demonstrieren, dass Pt-NP_PVP weder in den Zellen der Corti-Organ-Zelllinie noch in den primären SGZ eine zelluläre Aufnahme induziert und somit keine Signalkaskaden des Zelltodes auslöst.

In der zweiten Studie (Berger et al., 2024) wurden neben den HEI-OC1-Zellen und primären SGZ auch OC_exals In-vitro- und Ex-vivo-Zellkulturmodelle verwendet, um die zytotoxische Wirkung von Na₂(PtCl₆) als CI-assoziiertes Pt-Korrosionsprodukt zu untersuchen. Die HEI-OC1 Zellen wurden für 48 h kultiviert und mit 8-16 ng/µl Na₂(PtCl₆) angereichert. Die oxidative Aktivität nahm mit steigender Konzentration zwischen 8-16 ng/µl Na₂(PtCl₆) ab und die Färbung lebender Zellen mit Calcein AM/EthD zeigte eine zunehmende Anzahl von Zellen mit geschädigten Membranstrukturen. Ultrastrukturelle TEM-Untersuchungen ergaben Hinweise auf Mitophagie und Nekroptose. Die SGZ wurden für 48 h mit 15-35 ng/µl Na₂(PtCl₆) kultiviert und zeigten eine dosisabhängige Reduktion des neuronalen Überlebens und der Neuritogenese. Parallel dazu bestätigte die spezifische Antikörper-Antigen-Reaktion der Gliazellen und Fibroblasten einen dosisabhängigen Zelluntergang durch Na₂(PtCl₆). Die Exposition von OC_ex mit 25-45 ng/µl Na₂(PtCl₆) führte zu einem konzentrationsabhängigen schweren Haarzellverlust. Zum ersten Mal konnte eine konzentrationsabhängige Induktion des Zelltodes durch eine ionische Pt(VI)-Verbindung in Zelltypen und Geweben des Innenohres nachgewiesen werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass partikuläres Pt als Korrosionsprodukt, wie es in der Studie Berger et al. (2023) stellvertretend mit Pt-NP_PVP getestet wurde, keine direkte zytotoxische Wirkung auf Innenohrzellen zu haben scheint. Es bleibt zu klären, ob die fehlende zytotoxische Wirkung auf eine unterdrückte intrazelluläre Aufnahme von Pt durch die PVP-Beschichtung zurückzuführen ist oder ob die Innenohrzellen generell weniger empfindlich gegenüber Pt-induzierten Schäden sind. Das in der Studie Berger et al. (2024) verwendete ionische Na₂(PtCl₆) als CI-assoziiertes Pt-Korrosionsprodukt induziert dagegen oxidativen Stress, der konzentrationsabhängig zum Zelltod führt. Es ist zu klären, über welche aktiven Transportmechanismen die Korrosionsprodukte internalisiert werden und welche Zelltodsignalwege durch diese Platinverbindungen ausgelöst werden.

The aim of this dissertation was to characterise the potential cytotoxicity of cochlear implant (CI)-associated platinum (Pt) corrosion products on inner ear-specific cells and tissues for the first time. Commercially produced platinum nanoparticles stabilised with polyvinylpyrrolidone (PVP) (Pt-NP_PVP) and a Pt(IV) compound (sodium hexachloroplatinate (IV), Na₂(PtCl₆)), which does not belong to Pt based antineoplastic drugs, were investigated. Immortalised mouse organ of Corti cells (HEI-OC1) as well as primary spiral ganglion cells (SGC) and an organotypic culture of explants of the neonatal rat organ of Corti (OC_ex) were used as inner ear cells.

In the first study (Berger et al., 2023), HEI-OC1 cells and primary SGC were used as cell culture models to investigate the effects of Pt-NP_PVP on cell metabolism, neuronal survival and neurite outgrowth. The HEI-OC1 cells were exposed for 48 h to 50-150 µg/ml Pt-NP_PVP. The data showed neither a decrease in metabolic activity nor a reduction in vital cells using live staining with Calcein AM/Ethidium homodimer III (EthD). Transmission electron microscopy (TEM) also showed no impairment of the cells; no Pt-NP_PVP was found on the cell surface or in the cytosol of the HEI-OC1 cells. Primary SGC were exposed to 20-100 µg/ml Pt-NP_PVP for 48 h and the survival rate and neurite outgrowth were analysed independently of the non-neuronal part of the SGC after antigen-specific staining of the neurofilament. Even at the highest Pt-NP_PVP concentration, no reduction in survival or neurite outgrowth was observed. To investigate the cell morphology and growth behaviour of the non-neuronal part of the SGC, the incubation time was additionally extended to 72 or 96 h. Regardless of the incubation period, the detection of the expression of specific epitopes on glial cells and fibroblasts with anti-vimentin and anti-p75 antibodies showed normal cell morphology and physiological cell growth. The data obtained demonstrate that Pt-NP_PVP does not induce cellular uptake in the cells of the Corti organ cell line or in the primary SGC and thus does not trigger any signalling cascades of cell death.

In the second study (Berger et al., 2024), HEI-OC1 cells and primary SGC, as well as OC_ex, were also used as in vitro and ex vivo cell culture models to investigate the cytotoxic effect of Na₂(PtCl₆) as a CI-associated Pt corrosion product. HEI-OC1 cells were cultured for 48 h and enriched with 8-16 ng/µl Na₂(PtCl₆). The oxidative activity decreased with increasing concentration between 8-16 ng/µl Na₂(PtCl₆) and staining of living cells with Calcein AM/EthD showed an increasing number of cells with damaged membrane structures. Ultrastructural TEM examinations revealed evidence of mitophagy and necroptosis. SGC were cultured for 48 h with 15-35 ng/µl Na₂(PtCl₆) and showed a dose-dependent reduction in neuronal survival and neuritogenesis. In parallel, the specific antibody-antigen response of glia cells and fibroblasts confirmed a dose-dependent cell death by Na₂(PtCl₆). Exposure of OC_ex to 25-45 ng/µl Na₂(PtCl₆) resulted in a concentration-dependent severe hair cell loss. For the first time, a concentration-dependent induction of cell death by an ionic Pt(VI) compound was demonstrated in cell types and tissues of the inner ear.

In conclusion, particulate Pt as a corrosion product, such as tested in the study by Berger et al. (2023) using Pt-NP_PVP as a surrogate, does not appear to have a direct cytotoxic effect on inner ear cells. It remains to be clarified whether the lack of cytotoxic effect is due to a suppressed intracellular uptake of Pt by the PVP coating or whether the inner ear cells are generally less susceptible to Pt-induced damage. In contrast, the ionic Na₂(PtCl₆) used by Berger et al. (2024) as a CI-associated Pt corrosion product induces oxidative stress that leads to cell death in a concentration-dependent manner. The active transport mechanisms by which the corrosion products are internalised and the cell death signalling pathways triggered by these platinum compounds remain to be elucidated.