Interplay of Lipopolysaccharide and Alpha-Synuclein to Model Gut-Brain Pathophysiology in Parkinson’s DiseaseThe

Hartke, Anna-Sophia

Dissertation 2024 CC BY-NC-ND 4.0

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The Interplay of Lipopolysaccharide and Alpha-Synuclein to Model Gut-Brain Pathophysiology in Parkinson’s Disease

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Schon bevor die vergangene Pandemie die Aufmerksamkeit auf die Bedeutung von Infektionskrankheiten für das Fortschreiten der Morbus Parkinson (PD) lenkte, wurden Entzündungen im peripheren und zentralen Nervensystem nach viralen oder bakteriellen Infektionen als treibende Kraft hinter der Pathologie untersucht. Es wurde vermutet, dass die Interaktion mit alpha-Synuclein (aSyn) an diesem Prozess beteiligt ist. ASyn ist ein kleines Protein, das mit PD in Verbindung gebracht wird, da Mutationen im Gen, das für dieses Protein kodiert, zu einem frühen Ausbruch der Krankheit führen. Darüber hinaus unterstreicht seine große Häufigkeit in dem pathologischen Merkmal der Parkinson-Krankheit, den Lewy-Körperchen im Gehirn, seine Bedeutung für die Krankheit.

Das Endotoxin gramnegativer Bakterien, Lipopolysaccharid (LPS), ist kürzlich in den Fokus der Forschung gerückt, da gramnegative Bakterien im Darmmikrobiom in großer Zahl vorkommen und der LPS-Gehalt im Blut von PD-Patienten erhöht ist. Es wird vermutet, dass Endotoxin die Neurodegeneration im Gehirn verursacht oder dazu beiträgt. Dies ist im Einklang mit der Hypothese, dass die Pathologie hinter der Parkinson-Krankheit möglicherweise nicht in allen Fällen im Gehirn beginnt, sondern vom Darm über den Vagusnerv zum Gehirn aufsteigt.

Wir untersuchen das Zusammenspiel dieser beiden Faktoren, der aSyn-Pathologie und der LPS-Exposition, indem wir ein kombiniertes Modell erstellen. Thy1-aSyn-Mäuse (Linie 61) sind ein etabliertes PD-Modell, das menschliches aSyn überexprimiert und ein breites Spektrum von PD-Symptomen und -Pathologie rekapituliert. Durch Hinzufügen eines second hit mit einer einmaligen intraperitonealen Injektion von niedrig dosiertem LPS (0,8 mg/kg) bei Thy1-aSyn-Mäusen in einem frühen Stadium der Entwicklung des Phänotyps untersuchten wir, wie die Auswirkungen von LPS auf die aSyn-Überexpression die Entwicklung von Pathologie und Verhaltensdefiziten in diesem Modell beeinflussen. Vehikel-Injektionen dienten als Kontrolle und Wildtyp-Wurfgeschwister wurden als Vergleichstiere herangezogen. Klinische Parameter, immunhistochemische Untersuchungen des Gehirns, durchflusszytometrische Untersuchungen von Blut und Gehirn, sowie das Verhalten wurden zu fünf verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion untersucht. Um die kurzfristigen Folgen der LPS-Exposition zu untersuchen, wurden die Zeitpunkte drei, sieben und 14 Tage nach der Injektion ausgewertet. Erste Ergebnisse für die Zeitpunkte zwei und neun bis zehn Monate nach der Injektion wurden erstellt, um der Frage nachzugehen, ob die einmalige Injektion von LPS zu langfristigen Folgen führen kann.

Wie erwartet führte die niedrige LPS-Dosis zu einem vorübergehenden Gewichtsverlust und einer Hypothermie, die innerhalb von sieben Tagen nach der Injektion wieder verschwanden, und zwar nicht nur bei den transgenen Thy1-aSyn-Mäusen, sondern auch bei den Wildtyp-Wurfgeschwistern. Obwohl diese initiale Reaktion bei beiden Genotypen ähnlich zu sein schien, wurde sieben Tage nach der Injektion bei den transgenen, nicht aber bei den Wildtyp-Tieren, eine ausgeprägte Mikrogliose beobachtet. Eine entsprechende Zunahme von Monozyten und anderen Immunzellen wurde im Gehirn und im Blut der aSyn-überexprimierenden Mäuse beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Zunahme der Immunzellen im Blut ein möglicher früher Biomarker für die durch Endotoxin ausgelöste Neuroinflammation bei Parkinson-Patienten ist.

14 Tage nach der Injektion wurden unerwartete Veränderungen des aSyn-Spiegels in verschiedenen Hirnregionen festgestellt. LPS reduzierte die aSyn-Expression in Wildtyp-Tieren, nicht aber in transgenen Tieren, was auf eine Wirkung auf die Expression von endogenem aSyn hinweist, die durch das überexprimierte humane aSyn in transgenen Mäusen maskiert wird. Dieser Effekt war vorübergehend, denn bei Langzeitbeobachtungen, neun bis zehn Monate nach der Injektion, war aSyn bei den Wildtypen im Vergleich zu den Vehikel-Kontrollen nicht verändert. Umgekehrt war zu diesem späten Zeitpunkt aSyn in Thy1-aSyn-Mäusen im Vergleich zur Vehikel-Kontrolle erhöht. Dies deutet darauf hin, dass eine einzige LPS-Injektion die aSyn-Pathologie verstärken und damit zum Fortschreiten der Erkrankung beitragen kann.

Um zu untersuchen, wie sich die beobachtete Pathologie auf das Verhalten auswirkt, wurden die motorischen und kognitiven Defizite im LPS-Thy1-aSyn-Modell untersucht. Während 14 Tage nach der Injektion kein deutlicher Einfluss auf die leichten motorischen Defizite bei jungen Thy1-aSyn-Mäusen festgestellt werden konnte, zeigten sich zwei Monate nach der Injektion Veränderungen nicht nur im räumlichen Gedächtnis, sondern auch im angstähnlichen Verhalten im Y-Maze-Test. Die Veränderung des räumlichen Gedächtnisses wurde bei beiden Genotypen beobachtet, während die Veränderung des Angstverhaltens nur bei den Transgenen im Vergleich zu den Vehikel-Kontrollen zu beobachten war. Interessanterweise verringerte eine LPS-Exposition das angstähnliche Verhalten der transgenen Tiere, was auf eine Hemmung des verstärkten Erlernens von Angstverhalten bei aSyn-Überexpression hindeutet. Während der mögliche Mechanismus dahinter noch geklärt werden muss, deutet dies auf eine spezifische Auswirkung von LPS und seiner nachgeschalteten Pathologie auf das limbische System und entsprechende nicht-motorische Symptome bei Parkinson hin.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aSyn-Pathologie das periphere und das ZNS-Immunsystem anfälliger für periphere Toxine macht, was zu einer verstärkten Immunreaktion auf eine einmalige niedrige LPS-Dosis führt. Dieses Modell einer vorübergehenden Dysbiose oder Darminfektion legt nahe, dass bei PD Patienten eine engmaschigere Überwachung von scheinbar leichten Infektionen durchgeführt werden sollte. Weitere Studien, die sich mit den Auswirkungen einer vorübergehenden Entzündung und ihren langfristigen Folgen befassen, sind erforderlich, um zu verstehen, wie sich diese Beobachtungen auf die Patienten übertragen lassen. Ein frühzeitiges pharmakologisches Eingreifen könnte die krankheitsverstärkenden Folgen verhindern.

Even before the recent pandemic drew attention to the relevance of infectious diseases for the progression of Parkinson’s disease (PD), peripheral and central nervous system (CNS) inflammation following viral or bacterial infections were investigated as driving forces of pathology. Interactions with alpha-Synuclein (aSyn) were suspected to partake in this progress. ASyn is a small protein closely associated with PD, as known mutation in the gene encoding for this protein lead to an early disease onset. Furthermore, its high abundance in the pathological hallmark of PD, the Lewy bodies in the brain, emphasizes its importance in the disease.

The endotoxin of gram-negative bacteria, Lipopolysaccharide (LPS), was more recently moved into the focus of research due to the high abundance of gram-negative bacteria in the gut microbiome and the elevation of LPS in the blood of PD patients. It is hypothesized that endotoxin causes or contributes to neurodegeneration in the brain. This is in line with the hypothesis that the pathology of PD might not in all cases start in the brain but ascend from the gut via the vagus nerve to the brain.

We investigate the interaction of these two factors, the aSyn pathology and the LPS exposure, by employing a combined model. Thy1-aSyn mice (Line 61) are an established PD model that over-expresses human aSyn and recapitulates a broad range of PD symptoms and pathology. By adding a second hit with a single intraperitoneal injection of low dose LPS (0.8 mg/kg) in Thy1-aSyn mice at an early stage of phenotype progression, we investigated how the impact of LPS onto aSyn-overexpression affects the development of pathology and behavioral deficits in this model. Vehicle injections served as a control and wild-type littermates were included for comparison. Clinical parameters, brain immunohistochemistry, flow cytometry of blood and brain and the behavior were evaluated at five different time points post-injection. To investigate the short-term consequences of the LPS-exposure, the timepoints three, seven and 14 days post-injection were evaluated. First results for two and nine to ten months post-injection were generated to approach the question whether the single injection of LPS can translate into long-term consequences.

As expected, the low dose of LPS induced transient weight loss and hypothermia, resolving within seven days post-injection, not only in transgenic Thy1-aSyn mice but also in wild-type littermates. Although this initial response appeared to be similar for both genotypes, overt microgliosis was observed in the transgenic but not in wild-type animals at seven days post-injection. A corresponding increase in monocytes and other immune cells was observed in the brain and in the blood of aSyn over-expressing mice. This suggests increase of blood immune cells as early biomarker for endotoxin driven neuroinflammation in PD patients.

At 14 days post-injection, unexpected changes in the aSyn levels in several brain regions were detected. LPS reduced the aSyn expression in wild-type, but not in transgenic animals, indicating an effect on the expression of endogenous aSyn, which is concealed by the overexpressed human aSyn in transgenic mice. This effect was transient, as in long-term observations nine to ten months post-injection aSyn was not changed in wild-type compared to vehicle controls. Conversely, at this late time point aSyn was elevated in Thy1-aSyn mice compared to vehicle. This indicates that a single LPS injection may increase aSyn pathology and thereby contribute to disease progression.

To investigate how the observed pathology translates into behavioral deficits, the motor and the cognitive deficits were assessed in the LPS-Thy1-aSyn model. While at 14 days post-injection no robust influence on the slight motor deficits present in young Thy1-aSyn mice was detected, at two months post-injection alterations of not only spatial memory but also anxiety-like behavior were evident in the Y-Maze test. The alteration of spatial memory was observed in both genotypes, whereas the anxiety modification was only seen in the transgenics compared to vehicle controls. Interestingly, LPS-exposure reduced the anxiety-like behavior observed in the transgenic animals indicating disruption of the enhanced fear-learning present under aSyn over-expression. While the potential mechanism behind this still needs to be elucidated, it indicates a specific impact of LPS and its downstream pathology on the limbic system and corresponding non-motor symptoms in PD.

In conclusion, aSyn pathology renders the peripheral and CNS immune system more susceptible to peripheral toxins, leading to an increased immune response to the single low dose of LPS. This model of transient dysbiosis or gut infection suggests that for PD patients a closer monitoring of seemingly mild infections should be implemented. Further studies focusing on the effect of transient inflammation and its long-term consequences are needed to understand the translation of these observations to the patients. Early pharmacological intervention might be able to prevent the disease exacerbating consequences.