Tackling Animal Prion Diseases : a Genotyping and Prion Strain Typing Study

Prionenkrankheiten, besser bekannt als transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSEs), umfassen eine Gruppe progredienter, immer tödlich verlaufender neurodegenerativer Erkrankungen von Mensch und Tier und können infektiöser, sporadischer oder erblicher Ätiologie sein. TSE werden durch das pathologische Prion-Protein (PrPSc) verursacht, einer weitestgehend Proteinase-K-resistenten, überwiegend unlöslichen und infektiösen Fehlfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPC). Die derzeit bedeutendsten TSEs in Tieren sind die atypische und klassische Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) der Rinder, die atypische und klassische Scrapie der kleinen Wiederkäuer sowie die Chronic Wasting Disease (CWD) der Zerviden. Während der Erreger der klassischen BSE nachweislich auf verschiedene Spezies, inklusive den Menschen übertragbar ist, ist das zoonotische Potential aller anderen TSEs noch nicht vollständig geklärt. Es ist jedoch davon auszugehen, dass atypische TSE-Formen, sowie die CWD, mit großer Wahrscheinlichkeit keine Zoonosen darstellen. Ein zoonotisches Potenzial konnte für einzelne klassische Scrapie-Stämme jedoch experimentell gezeigt werden. Der Ausbruch einer TSE stellt, aufgrund des dem PrPSc innewohnenden zoonotischen Potenzials ein Risiko für die öffentliche Gesundheit dar und kann vor allem in der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung verheerende ökonomische Verluste nach sich ziehen, wie die BSE-Krise eindrucksvoll gezeigt hat. Eine eingehende Untersuchung des Infektionserregers und der TSE-empfänglichen Tierpopulationen ist daher notwendig, um die aktuelle Ausbruchslage besser einschätzen und frühzeitig neue, zielgerichtete Tierseuchenbekämpfungsmaßnahmen einleiten zu können. Prion-Proteine sind sehr anpassungsfähige Moleküle, die zahlreiche Konformationen und dadurch unterschiedliche biologische Eigenschaften annehmen können. Diese wiederum werden durch Übertragungsexperimente, biochemische, histopathologische und immunhistochemische Methoden nachgewiesen. Eine solche Charakterisierung ermöglicht schließlich die Definition eines sogenannten „Prion-Stammes“. Deren Entstehung ist eng mit der Fähigkeit von PrPSc verbunden, sich an das PrPC eines neuen Wirts anzupassen, um es zu PrPSc zu konvertieren, d.h. die Transmissionsbarriere zu überwinden. Dieser Prozess kann durch verschiedene, zum Teil noch unbekannte Faktoren beeinflusst werden. Ein wesentlicher Faktor, insbesondere in kleinen Wiederkäuern und Zerviden, ist die Primärstruktur von PrPC, kodiert durch das Prion-Proteingen (PRNP). Daher befasst sich der erste Teil dieser Dissertation mit einer repräsentativen Untersuchung des PRNP in zentraleuropäischen Hirscharten, um das Risikopotential von CWD für diese Populationen besser einschätzen zu können. Ein zusätzlicher Risikofaktor sind die bereits zirkulierenden und Umwelt kontaminierenden Prion-Stämme, deren Zahl und Eigenschaften weitestgehend unbekannt sind. Im zweiten Teil dieser Dissertation erfolgt daher die Charakterisierung von europäischen Ziegen-TSE-Isolaten mittels Übertragungs-versuchen in einem etablierten transgenen Mausmodell. Dabei wurden zudem Parameter definiert, die eine eindeutige Diskriminierung von capriner BSE (gtBSE), sowie klassischer und atypischer Scrapie ermöglichen. Die Untersuchungen zur Variabilität des PRNP in einheimischen Zerviden, die in Manuskript I genau erläutert werden, umfassten insgesamt 911 PRNP-Sequenzen der drei bedeutendsten Jagdwildarten: Rehe, Rotwild und Sikawild, sowie eine kleine Population von 26 dänischen Rothirschen. Sowohl Rehe als auch das Sikawild erwiesen sich dabei als sehr homogene Populationen, in beiden Spezies traten bei wildlebenden Tieren keine Aminosäureaustausche auf, lediglich Polymorphismen in Form stiller Mutationen waren in einzelnen Individuen beider Spezies, nachweisbar. Bei zwei als Gatterwild gehaltenen Sikahirschen, konnte hingegen ein Aminosäureaustausch an Codon 226 festgestellt werden, der in dieser Form auch im Rotwild auftritt. Da Rot- und Sikawild phylogenetisch sehr eng verwandt sind, ist davon auszugehen, dass es sich bei beiden Tieren sehr wahrscheinlich um Sika-Rotwild-Hybride handelt. Im Kontrast zu Reh- und Sikawild, erwies sich das Rotwild-PRNP mit 14 verschiedenen Genotypen als sehr variabel und zeigte Aminosäureaustausche an den Codons 98, 226 und 247 sowie vier stille Mutationen an den Codons 21, 78, 136 und 185. Zudem wurde im Rotwild erstmals eine 24 Basenpaar (bp) lange Deletion innerhalb der Oktapeptid-Repeat-Region detektiert. Der PRNP-Wildtyp war dabei deutlich seltener zu finden als das E226-Allel, am seltensten trat das A98-Allel auf. Eine geografische Analyse der Rotwild-PRNP Sequenzen führte zur Identifikation von Clustern bestimmter Polymorphismen in verschiedenen Regionen. Dabei war die Nord-Süd-Diskrepanz zwischen dem A98- und dem E226-Allel am auffälligsten: Während A98 vorwiegend bei Rotwild aus südlichen Habitaten auffiel, war die Häufigkeit für das E226-Allel in den nördlicheren Lebensräumen deutlich höher, eine Beobachtung, die sich in der dänischen Population fortsetzte. Des Weiteren wurden Tiere mit der 24 bp Deletion überwiegend im Südwesten Deutschlands, an der Grenze zu Frankreich, Luxemburg und Belgien detektiert. Das L247-Allel kam nahezu ausschließlich bei Tieren vor, die nahe der tschechischen Grenze lokalisiert waren. Die in Manuskript II dargestellte Studie ist vergleichbar zu Manuskript I, allerdings liegt hierbei der Fokus auf der PRNP-Varianz französischer Reh- und Rotwild-Populationen. In beiden Tierarten zeigten sich vergleichbare Ergebnisse zu Manuskript I, dies betrifft sowohl die Häufigkeit und die geografische Verteilung des A98- und des E226-Allels beim Rotwild, als auch die bereits beschriebenen PRNP-Cluster. In weiterer Übereinstimmung mit Manuskript I, wurde die 24 bp Deletion überwiegend in der Nähe der deutschen, belgischen und luxemburgischen Grenze gefunden. Allerdings wurde im französischen Rotwild, weder das L247-Allel noch die stille Mutation an Codon 185 festgestellt, so dass insgesamt 12 statt 14 Genotypen nachgewiesen werden konnten. Das Manuskript II bestätigt zudem die Homogenität der europäischen Rehwildpopulationen. Mit Ausnahme eines einzigen heterozygoten Tieres, das einen neuen Polymorphismus an Codon 37 aufwies, waren alle französischen Rehe homozygot für den PRNP-Wildtyp. Die Analyse der Daten aus Manuskript I und II zeigt eindrücklich, dass die geographische Verteilung der PRNP-Sequenzen nicht nur mit den Daten weiterer PRNP-Studien aus unterschiedlichen europäischen Ländern übereinstimmt, sondern auch in den Kontext phylogeographischer Rotwildstudien einzuordnen ist. Letztendlich muss jedoch nach aktuellem Kenntnisstand davon ausgegangen werden, dass die zentraleuropäischen Zerviden vermutlich hochempfänglich für die CWD sind. Diese Schlussfolgerung ergibt sich aus Vergleichsanalysen mit nordamerikanischen CWD-Fall- und Genotypisierungsstudien sowie PRNP-Untersuchungen in den fennoskandi-navischen Ausbruchsgebieten. In Manuskript III wurde im Rahmen eines europäischen Verbundprojektes ein Proben-Panel aus 35 TSE-Fällen europäischer Ziegen zur weiterführenden Prion-Stammcharakterisierung im Tgshp IX Mausmodell, das das ovine PrPC überexprimiert, ausgewählt. Diese Isolate stammen vorwiegend von Ausbrüchen klassischer Scrapie, schlossen aber auch Proben atypischer Scrapie, des experimentellen CH1641-Stammes und capriner BSE (gtBSE) mit ein. Die immunhistochemische Untersuchung der Tgshp IX-Mausgehirne (PrPSc-Profil) ermöglichte eine eindeutige Diskriminierung zwischen atypischer und klassischer Scrapie, sowie des CH1641-Isolates und gtBSE. Bei der folgenden systematischen Untersuchung der klassischen Scrapie-Isolate konnte bereits mittels der geographischen Metadaten, der Übertragungsrate und der Inkubationszeit, eine Einteilung in drei Kategorien (CS-1-3) vorgenommen werden, die durch das PrPSc-Profil bestätigt wurde. Während der Großteil der Isolate in der ersten Kategorie zusammengefasst werden konnte (CS-1), zeigten die italienischen Isolate eine deutliche Abgrenzung und wurden folglich als Gruppe CS-2 kategorisiert. Ein einzelnes französisches Isolat wurde aufgrund seiner abweichenden Merkmale zudem als einziges Isolat der Kategorie CS-3 zugeordnet. Deutliche Unterschiede zwischen den Prion-Stämmen waren vor allem im Kleinhirn, im Corpus Callosum und anhand des zellulären Reaktionsmusters der PrPSc-Ablagerungen erkennbar. Sowohl das Kleinhirn, als auch das Corpus Callosum sind Regionen, die von der standardisierten Methode der Prion-Stammcharakterisierung abweichen. Die von den Verbundpartnern bereits veröffentlichten Daten derselben Isolate, die dort mit anderen Methoden untersucht wurden, zeigten bei einer vergleichenden Analyse eine große Übereinstimmung bei der Definition der unterschiedlichen Prion-Stämme untereinander, wie auch mit der vorliegenden Studie. Dies betrifft auch den zusätzlichen Nachweis verschiedener, im Original-Isolat verdeckter, Sub-Stämme, die Ähnlichkeiten zu gtBSE und dem CH1641-Isolat zeigten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das Tgshp IX-Mausmodell ein sehr sensitives und äußerst zuverlässiges Tier-Modell für die Prion-Stammcharakterisierung darstellt. Die vorliegende Studie unterstreicht zudem, dass das traditionelle „Prion Strain Typing“ modifiziert werden sollte, um der neu hinzugekommenen Verwendung verschiedener transgener Mausmodelle Rechnung zu tragen. Dazu gehört auch die Erstellung eines standardisierten PrPSc-Profils mit Hinzunahme weiterer Hirnareale (z.B. Kleinhirn und Corpus Callosum). Die beschriebene Modifikation und vor allem eine weitergehende Standardisierung des „Prion Strain Typing“-Ansatzes würde auch dem 3R-Prinzip Rechnung tragen, indem es die erforderlichen Mausmodelle auf ein Minimum reduziert. Abschließend kann festgestellt werden, dass sowohl die Untersuchung der PRNP-Genvarianten potenzieller Wirtspopulationen, als auch die Charakterisierung des in einem Ausbruch vorliegenden Prion-Stammes, nach wie vor die wichtigsten Informationen zur Charakterisierung der biologischen Eigenschaften von Prion-Erkrankungen bei Tieren sind. Kontroll- und Tilgungsmaßnahmen können damit effektiv an neu auftretende und/ oder potenziell zoonotische Prion-Stämme angepasst werden. Die sich aktuell stetig weiter ausbreitende CWD unterstreicht die Notwendigkeit dieses Wissens.