effect of different variables and pharmacological treatment on neonatal seizures and long-term adverse outcome in a rat model of birth asphyxiaThe

Schmidt, Ricardo

DissertationCC BY 4.02024Published

The effect of different variables and pharmacological treatment on neonatal seizures and long-term adverse outcome in a rat model of birth asphyxia

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Geburtsasphyxie (BA) ist eine der Hauptursachen für hypoxisch-ischämische Enzephalopathie (HIE) und kann zu neonatalen Krampfanfällen führen. Trotz ihrer bedeutsamen Langzeitfolgen, darunter motorische, kognitive und sensorische Beeinträchtigungen sowie Epilepsie, sind die derzeitigen therapeutischen Möglichkeiten begrenzt. Des Weiteren ist bekannt, dass mehrere Faktoren, einschließlich Geschlecht, Stress und verschiedene biologische Rhythmen, Krampfanfälle in erwachsenen Patienten beeinflussen können. Der Effekt dieser Einflussfaktoren auf Anfälle in Neugeborenen ist jedoch unbekannt. Um das Verständnis der BA, HIE und neonataler Anfälle zu verbessern und somit neue Therapieoptionen entwickeln zu können, werden geeignete Tiermodelle benötigt. Daher haben wir ein nicht-invasives, physiologisch validiertes Rattenmodell der BA verwendet, das zudem viele Aspekte der BA und HIE humaner Patienten widerspiegelt. Somit konnten wir bereits aufzeigen, dass das Benzodiazepin Midazolam neonatale Anfälle in ~50% der behandelten Tiere verhinderte, was seiner klinischen Effektivität entspricht. Hier nutzten wir dieses BA-Modell, um den Einfluss unterschiedlicher Faktoren auf neonatale Anfälle, die zeitliche Entwicklung spontaner wiederkehrender Krampfanfälle (SRS), d. h. Epilepsie, und den therapeutischen Effekt von Midazolam auf die Kurz- und Langzeitfolgen der Asphyxie zu untersuchen.

Am 11 Tag nach der Geburt wurde eine Asphyxie durch ein 30-minütiges Protokoll aus sich abwechselnden Sauerstoffkonzentrationen (7 Minuten bei 9% Sauerstoff und 3 Minuten bei 5% Sauerstoff) und einem konstant erhöhten Kohlenstoffdioxidgehalt von 20% induziert. Die Behandlung der Tiere bestand entweder aus einem Vehikel oder Midazolam (1 mg/kg), welches direkt nach der Asphyxie intraperitoneal verabreicht wurde. Anschließend wurden die Ratten über unterschiedliche Zeitspannen bis zu einer Dauer von 14 Monaten, untersucht. Einem Teil der Tiere wurden Elektroden zur Erfassung der Anfallsaktivität implantiert und ihre Krampfschwelle wurde anhand von zwei Tests ermittelt. Zusätzlich wurden in einer weiteren Kohorte das Verhalten der Tiere und ihre histopathologischen Veränderungen mittels zweier Verhaltenstests und verschiedener immunhistochemischer Marker untersucht.
Alle Tiere der Vehikel-Gruppe entwickelten akute neonatale Anfälle nach der Asphyxie. Während eine erste Auswertung der Daten auf einen saisonalen Effekt hindeutete, zeigte eine genauere Analyse aller Einflussfaktoren, dass Saison, Tageszeit und Geschlecht keinen Einfluss auf neonatale Anfälle hatten. Im Gegensatz dazu beeinflusste leichter, kurzzeitiger Stress (~5 s Handling und Vehikelinjektion) die Anfallscharakteristika stark. Zusätzlich führte die Asphyxie zur zeitlichen Entwicklung von SRS und steigerte ihre Inzidenz von 0% 2,5 Monate nach der Asphyxie auf 100% nach 10,5 Monaten. Überraschenderweise unterschied sich die Anfallsschwelle zu verschiedenen Zeitpunkten nach Asphyxie nicht signifikant zwischen den Gruppen. Interiktale epileptiforme Entladungen traten unabhängig von der Behandlungsgruppe oder der späteren Entwicklung von SRS auf. Die Behandlung mit Midazolam unterdrückte das Auftreten neonataler Anfälle in >50% der Tiere, was die Ergebnisse unserer vorherigen Studie widerspiegelt. Außerdem verhinderte Midazolam die durch die Asphyxie verursachte zeitliche Entwicklung der SRS. Auch Veränderungen des Verhaltens, einschließlich des Angst-assoziierten Verhaltens im light-dark box test und der Beeinträchtigung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses im radial-arm water maze, konnten durch Midazolam abgewandt werden. Zusätzlich beeinflusste Midazolam die histopathologischen Veränderungen nach der Asphyxie und verhinderte oder reduzierte die akute Neuroinflammation und das spätere abnorme Aussprossen von Moosfasern sowie die Neurodegeneration des Hippocampus und Thalamus. Während neonatale Anfälle generell nicht zu den negativen Folgen der Asphyxie beitrugen, resultierte ihr Auftreten in einer verstärkten Neurodegeneration im Thalamus.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studien tragen zur umfassenden Charakterisierung eines nicht-invasiven BA-Modells bei. Der beobachtete Einfluss von akutem, kurzzeitigem Stress sollte bei der Planung zukünftiger Studien in diesem BA-Modell und anderen Modellen neonataler Anfälle berücksichtigt werden. Außerdem eröffnet die beschriebene Latenzperiode zwischen der initialen Hirnschädigung und dem späteren Auftreten von SRS die Möglichkeit, potenzielle Therapien in diesem therapeutischen Fenster zu untersuchen. Die deutliche anfallsunterdrückende und krankheitsmodifizierende Wirkung Midazolams machen das Benzodiazepin zu einem vielversprechenden Arzneimittelkandidaten für die Behandlung von Neugeborenen mit HIE und neonatalen Anfällen. Des Weiteren sprechen diese Studien für keinen wesentlichen Einfluss von neonatalen Anfällen auf die Folgen der HIE. Interiktale epileptiforme Entladungen im EEG scheinen nicht als Biomarker für Epileptogenese in diesem Modell geeignet zu sein. Zusammenfassend tragen die Studien zur Validität eines nicht-invasiven Rattenmodells der BA bei und zeigen dessen Potenzial für die Entwicklung neuer Therapien für HIE und ihrer Folgen.

Birth asphyxia (BA) stands as a primary cause of hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), resulting in neonatal seizures. Despite the severe long-term consequences including adverse motor, cognitive, and sensory outcomes, as well as epilepsy, available therapeutic options remain limited. Moreover, several factors including sex, stress, and different biological rhythms have been identified to influence seizures in adult patients yet their impact on neonatal seizures remains unknown. To enhance the understanding of BA, HIE, and neonatal seizures and to develop novel treatment strategies, suitable animal models are required. Therefore, we employed a non-invasive, physiologically validated rat model of BA, mimicking numerous aspects of BA and HIE observed in human patients. In a recent study, we have demonstrated that the benzodiazepine midazolam prevented neonatal seizures in ~50% of treated animals, which is in line with its clinical efficacy in neonates. Here, we utilized this BA model to study the impact of various influencing factors on neonatal seizures, the temporal development of spontaneous recurrent seizures (SRS), i.e. epilepsy, and the therapeutic effect of midazolam on the short- and long-term outcomes following asphyxia.

Thus, at postnatal day 11, intermittent asphyxia was induced for a total duration of 30 minutes through three cycles of alternating oxygen concentrations (7 minutes of 9% oxygen and 3 minutes of 5% oxygen), with a steady level of 20% carbon dioxide. Treatment involved either vehicle or midazolam (1 mg/kg) which was injected intraperitoneally directly following asphyxia. Subsequently, rats were monitored over various time intervals up to a total duration of 14 months. In a subset of animals, electrodes were implanted to repeatedly monitor the seizure activity and two different tests were employed to assess the seizure threshold. Furthermore, the behavioral and histopathological outcomes were examined in a separate cohort of animals by using two behavioral tests and different immunohistochemical markers.

Following asphyxia, all vehicle-treated animals developed acute neonatal seizures. While a first assessment of the data suggested a seasonal influence, a more in-depth analysis of all influencing factors revealed that season, daytime, and sex did not impact neonatal seizures. In contrast, mild short-term stress (~5 s of handling and vehicle injection) significantly impacted seizure characteristics. Moreover, asphyxia induced to the temporal development of SRS, escalating their incidence from 0% at 2.5 months post-asphyxia to 100% at 10.5 months. Surprisingly, no notable inter-group differences were observed in seizure thresholds at different intervals after asphyxia. Interictal epileptiform discharges occurred in the EEG regardless of treatment group or later onset of SRS. Treatment with midazolam suppressed neonatal seizures in >50% of the animals, aligning with our prior findings. Furthermore, midazolam prevented the asphyxia-mediated temporal development of SRS and the adverse behavioral outcomes including anxiety-related behavior in the light-dark box test and impaired spatial learning and memory in the radial-arm water maze. In addition, midazolam impacted the histopathological outcomes following asphyxia, preventing or reducing the acute neuroinflammation, and later-life aberrant mossy fiber sprouting, as well as neurodegeneration in the hippocampus and thalamus. While neonatal seizures generally did not contribute to the adverse outcomes of asphyxia, their occurrence resulted in a higher degree of neurodegeneration in the thalamus compared to post-asphyxial animals without seizures.

The results of the present studies contribute to the in-depth characterization of the novel non-invasive model of BA. The identified impact of acute short-term stress on neonatal seizures should be taken into consideration when designing future studies both in the employed BA model and other models of neonatal seizures. Furthermore, the described latency period between the initial brain insult and the occurrence of later-life SRS opens the possibility of future studies exploring potential therapeutic options utilizing this therapeutic window. The marked disease-modifying effects of midazolam indicate that this benzodiazepine is a promising drug candidate for improving the long-term outcome of newborn patients with HIE and neonatal seizures. Moreover, these studies contribute to two ongoing debates, (1) whether neonatal seizures might contribute to the adverse outcomes of BA and HIE, and (2) whether interictal epileptiform discharges can be utilized as biomarkers during epileptogenesis, providing evidence against both theories. In summary, the reported studies not only further validate a non-invasive rat model of BA but also demonstrate its potential for the development of new therapeutic strategies of HIE and their adverse outcomes.