Investigations into porcine rotavirus cell entry and infection of porcine intestinal epithelial cells

Yan, Miaomiao

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Investigations into porcine rotavirus cell entry and infection of porcine intestinal epithelial cells

German
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Durchfall ist eine der größten erregerbedingten Belastungen für die
Schweineindustrie und führt zu einem Rückgang der Schweinefleischproduktion. Das Porcine Rotavirus (PRV), insbesondere die
Spezies A PRV (PRV A), ist einer der Hauptursachen für Durchfallerkrankungen bei gesäugten und entwöhnten Ferkeln. Die genaue Wechselwirkung und Interaktion zwischen Darmepithelzellen und enterischen Krankheitserregern sind aufgrund des Mangels an Zellkulturmodellen, die die zelluläre Vielfalt, Architektur und Funktionalität des Darms genau nachbilden können, noch nicht vollständig geklärt. Es ist bekannt, dass das murine Rotavirus (MRV) hauptsächlich reife Enterozyten in der Mitte und an der Spitze der Darmzotten infiziert. Es bleibt jedoch unklar, ob MRV auch andere Zelltypen infizieren kann. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass Rotaviren (RV) bevorzugt von der apikalen Oberfläche polarisierter Zellen freigesetzt werden, wurden widersprüchliche Ergebnisse bezüglich des RV-Eintritts berichtet. Es wird allgemein angenommen, dass VP8* von P[11] RV an Vorläufer von H-Typ Ioder Typ II-Antigenen bindet. Es bleibt jedoch unklar, ob sie auch andere Rezeptoren nutzen. Gleichzeitig wird die polarisierte intrinsische angeborene Immunantwort nur selten diskutiert. Um die Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und RV besser zu verstehen, sind in dieser Arbeit dreidimensionale (3D) und zweidimensionale (2D) Primärzellkulturen etabliert worden. Diese umfassen 3D-Schweine-Enteroiden in zweierlei Polarität (basolateral-außen und apikal-außen Enteroide) und 2D-undifferenzierte und differenzierte Schweine-Darmepithelzellen (PIEC). Der erste Teil dieser Arbeit zeigt auf, dass PRV neben Enterozyten auch Becherzellen und Paneth-Zellen in sowohl apikal-außen Enteroiden als auch in 2D-differenzierten PIEC infiziert. Obwohl die apikale als auch die basolaterale Membran von 2D-differenzierten PIEC Eintrittspforten für PRV darstellen, induzierten Infektionen über die basolaterale Membran eine stärkere Expression von Interferonen und inflammatorischen Genen im Vergleich zu Infektionen über die apikale Membran. Im zweiten Teil konnte gezeigt werden, dass 2D undifferenzierte PIEC neben 2D differenzierten PIEC ebenfalls anfällig für PRV sind. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass VP8* von P[11] PRV an Vorläufer von H-Typ-II-Antigenen binden kann, ähnlich wie VP8* von anderen P[11] RVs, wie menschlichen und bovinen RVs. Bemerkenswert ist die Rolle der Sialinsäure-Reste hinsichtlich der initialen Zellinteraktion. Es zeigte sich, dass das P[11] PRV Sialinsäuren (SA) an der subterminalen Position von Gangliosiden als molekulare Determinanten für den Viruseintritt nutzen kann und zwar sowohl in MA104-Zellen als auch in undifferenzierten 2D-PIEC. Dies steht im Kontrast zu Berichten, dass VP8* anderer P[11] RVs keine SA-Reste erkennen kann. Insbesondere ist herauszustellen, dass das P[11] PRV dieses Phänomenen als NA resistenter Virusvertreter zeigt. Unser Ergebnis stellt damit Stringenz der Annahme in Frage, dass NA-unempfindliche Stämme kein SA für ihren Eintritt verwenden. Zusammenfassend bieten Enteroide oder aus Enteroiden gewonnene Zellkulturen wertvolle Primärzellkulturmodelle zur Analyse der Invasions- und
Replikationsstrategien von enterischen Krankheitserregern sowie zur Untersuchung der durch diese Krankheitserreger induzierten Immun- und
Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus können die P[11] RV, von denen
bisher angenommen wurde, dass sie Vorläufer von Histo BlutgruppenAntigenen (HBGA) erkennen, auch Ganglioside mit subterminalen SAs für den Zelleintritt und die Infektion nutzen. Dies zeigt, dass Sialinsäuren nicht nur für NA-sensitive RVs, sondern auch für NA-resistente RVs wichtig sind.

Diarrhea is one of the major pathogen related burdens of the pig industry, causing a decline in pork production. Porcine rotavirus (PRV), especially species A PRV (PRV A), is one of the primary etiologic pathogens leading to diarrheal disease in suckling and weaned piglets. The interactions of intestinal epithelial cells with enteric pathogens have not been fully elucidated due to the lack of cell culture models that can accurately
recapitulate the cellular diversity, architecture, and functionality of the intestine. It is known that murine rotavirus (MRV) predominantly infects mature enterocytes at the middle and top of intestinal villi. However, it remains unclear whether PRVs can infect other cell types. Although it has been described that rotaviruses (RVs) are preferentially released from the apical surface of polarized cells, conflicting results have been reported regarding RV entry. Presently, it is widely accepted that VP8* of P[11] RVs
binds to precursors of H-type I or type II antigens. However, it remains ambiguous whether they also utilize other receptors. At the same time, the polarized intrinsic innate immune response is rarely discussed. To better understand the interactions between intestinal epithelial cells and RVs, we established three-dimensional (3D) and twodimensional (2D) primary cell cultures, comprising 3D porcine enteroids (basolateralout and apical-out enteroids) and 2D undifferentiated and differentiated porcine intestinal epithelial cells (PIECs). In Study I, our results show that PRV infects goblet cells and Paneth cells in addition to enterocytes in both apical-out enteroids and 2D differentiated PIECs. Although both the apical and basolateral membranes of 2D differentiated PIECs are susceptible to PRV, infections through the basolateral membrane induced stronger expression of interferons and inflammation-related genes compared to infections through the apical plasma membrane. In Study II, we show that 2D undifferentiated PIECs are also susceptible to PRV. We confirmed that VP8* of P[11] PRV can bind to precursors of Htype II antigens, similarly to VP8* of other P[11] RVs, such as human and bovine RVs. Surprisingly, we found that neuraminidase (NA)-resistant P[11] PRV can use sialic acids (SAs) at subterminal positions of gangliosides as molecular determinants for viral entry in both MA104 cells and 2D undifferentiated PIECs, even though it has beenreported that VP8* of other P[11] RVs cannot recognize SA residues. Our finding challenges the stringency of the rational that NA-resistant strains are not using SAs for their entry. In conclusion, enteroids or enteroid-derived cell cultures provide valuable primary cell culture models for analyzing the invasion and replication strategies of enteric pathogens, as well as for studying the immune and inflammatory responses induced by these pathogens. Moreover, the P[11] RVs, which were previously believed to recognize precursors of histo-blood group antigens (HBGAs), can also utilize gangliosides containing subterminal SAs for cell entry and infection. This indicates that SAs are important not only for NA-sensitive RVs but also for NA-resistant RVs.