Optimizing Flow Cytometric Sexing of Unfit Bull Sperm Using Microfluidic Sorting: A Comparative Study with Density Gradient Centrifugation and Swim-Up on Sperm Quality and In Vitro Embryo Production

Kalyoncu, Oğuzhan

Published

Optimizing Flow Cytometric Sexing of Unfit Bull Sperm Using Microfluidic Sorting : A Comparative Study with Density Gradient Centrifugation and Swim-Up on Sperm Quality and In Vitro Embryo Production

German
English

In dieser Arbeit wurden Proben mit künstlich induzierten Schäden verwendet, um Protokolle für die Analyse der Spermienvitalität mittels Durchflusszytometrie und für die computergestützte Analyse von Spermienbewegungsmustern zu erstellen. Dabei fanden wir die Proben, die mit beschädigten Spermien angereichert waren, besonders nützlich, um die Wirksamkeit verschiedener Spermienselektionsverfahren zu testen.

Das Hauptziel dieser Arbeit war es zu bewerten, wie Mikrofluidik-Chips bei der Auswahl von qualitativ hochwertigen Spermien im Vergleich zu anderen Techniken, wie dem Swim-up-Verfahren und der Percoll-Dichtegradientenzentrifugation abschneiden. Zusätzlich planten wir zu testen, ob mit der mikrofluidischen Spermienselektion ausgewählte Spermien ein besseres Bewegungsverhalten und eine erhöhte Befruchtungsfähigkeit in vitro aufweisen. Ebenso sollte die Leistung während der Durchflusszytometrie-basierten X/Y-Spermien-Sortierung bewertet werden. Sowohl frisch verdünnte als auch kryokonservierte Spermien wurden getestet, wobei auch individuelle Unterschiede berücksichtigt wurden.

Wir stellten fest, dass bei der Verwendung der mikrofluidischen Chips und Swim-up-Methoden die Spermienwiedergewinnungsrate gering war, die Spermien jedoch bessere Vitalitätsmerkmale aufwiesen. Bei der Verwendung der Percoll- Dichtegradientenzentrifugation war die Spermienwiedergewinnungsrate höher, dies ging jedoch mit einer erhöhten Anzahl von membrangeschädigten und beweglichen Spermien einher. Neben dem Vorhandensein eines hohen Prozentsatzes an beweglichen Spermien wiesen qualitativ hochwertige Spermienproben charakteristische kinematische Parameter auf, darunter eine erhöhte Bewegungs- und Lineargeschwindigkeit, die auch in viskösen Medien, welche die Eileiterflüssigkeit nachahmen, aufrechterhalten wurde. In unseren Untersuchungen führte die erhöhte Spermienqualität nach der Mikrofluidik-Selektion im Vergleich zu herkömmlichen Verarbeitungsverfahren nicht zu einer gesteigerten In-vitro-Embryoproduktion. Dennoch schien die Durchführung der mikrofluidischen Spermienselektion vor der Durchflusszytometrie-basierten X/Y-Spermien-Sortierung von Vorteil zu sein, da dies die anfängliche Spermienqualität auf das erforderliche Niveau anhob, den Anteil an toten Spermien während der FACS-Sortierung reduzierte und die Sortiergeschwindigkeit sowie die Anzahl korrekt ausgerichteter X-chromosomentragender Spermien signifikant verbesserte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Einsatz der mikrofluidischen Spermienselektion großes Potenzial in der Reproduktionsmedizin und in der assistierten Fortpflanzungstechnologie der Veterinärmedizin hat. Sie ermöglicht nicht nur eine einfache Auswahl und Anreicherung von qualitativ hochwertigen Spermien, die mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Eizelle befruchten, sondern dient auch als Verarbeitungsschritt, um die Anforderungen für eine erfolgreiche Durchflusszytometrie-basierte X/Y-Spermien-Sortierung zu erfüllen.

In this work we used samples with artificially induced damage for establishing protocols for flow cytometric analysis of sperm viability, as well as computer assisted analysis of sperm motility patterns. Moreover, we found that samples previously enriched with damaged sperm were especially useful for testing the effectiveness of different sperm selection procedures.

The major aim of this work was to evaluate how microfluidic chips perform in selecting high quality sperm, i.e., in comparison to other techniques such as swim-up and percoll density gradient centrifugation. In addition, we planned to test if sperm selected, using microfluidic chips exhibit better motility behavior, increased fertilization capacity in vitro, and wanted to evaluate the performance with the flow cytometric X/Y-sperm sorting.

Both, freshly diluted and cryopreserved sperm were tested also taking into account the variation among individuals. We determined that when using microfluidic sorting and swim-up methods, sperm recovery was low, however, sperm were of superior quality. Sperm recovery was higher after using percoll density gradient centrifugation, but this coincided with the presence of increased numbers of membrane damaged and motile sperm. In addition, the presence of a relatively high ratio of motile sperm in high quality sperm samples exhibited characteristic kinematic parameters including increased movement velocity and linearity; which was maintained when specimens were investigated in viscous media, mimicking oviductal fluid. In our hands, when compared with ordinary processing, remained that the increased sperm quality after microfluidic selection did not result an increased in vitro embryo production. Nonetheless, performing microfluidic sperm selection prior to flow cytometric sorting of X/Y-sperm appeared beneficial; since this improved initial sperm quality to required levels, reduced contents of debris and dead sperm during FACS sorting, and enabled to significantly improve sorting speed and the correctly oriented X-chromosome bearing sperm numbers in the population.

In conclusion, the use of microfluidic chips has great potential in reproductive medicine and veterinary assisted reproduction technologies. This is not only beneficial for any easier selection and enrichment of high quality sperm samples, which are more likely to fertilize an oocyte, but as a processing step, also for fulfilling the requirements needed for successful flow cytometric sorting of X/Y chromosome bearing sperm.