The multi-faceted genetically determined carbohydrate malabsorption in irritable bowel syndrome (IBS) : impact of gene variants in IBS on the trafficking, sorting and function of sucrase-isomaltase

Die Verdauung von Glykogen, Saccharose, Maltose und anderen aus Kohlenhydraten gewonnenen Disacchariden im Darmlumen erfolgt durch die konzertierte Aktion einer Familie von mikrovillaren Enzymen, den Disaccharidasen. Die Verdauung der α-glykosidischen Bindungen von Kohlenhydraten beginnt durch α-Amylasen aus dem Speichel und der Bauchspeicheldrüse und wird im Dünndarm durch zwei wichtige mukosale α-Glykosidasen fortgesetzt, die Sucrase-Isomaltase (SI EC 3.2.148 und 3.2.1.10) und die Maltase-Glucoamylase (MGAM¸ EC 3.2.1.20 und 3.2.1.3). Die dritte Disaccharidase, die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH), ist eine α-Galactosidase, deren Hauptfunktion im Darm darin besteht, Lactose, D-Galactopyranosyl-β-(1→4)-D-Glucopyranose, den Hauptzucker der Säugetiermilch, zu verdauen. SI weist ein breites α-Glucosidase-Aktivitätsprofil auf, das α-1,2-, α-1,4- und α-1,6-Verknüpfungen verdaut und kooperiert mit MGAM beim Verdauen von α-1,4-Verknüpfungen, den wichtigsten glykosidischen Verknüpfungen in stärkehaltigen Lebensmitteln. SI und MGAM sind Mitglieder der Glykosylhydrolase-Familie 31 (GH31), mit einer bemerkenswerten 58%igen Identität in ihrer Aminosäuresequenz und einer 74,3%igen Ähnlichkeit auf der Grundlage einer globalen paarweisen Sequenzalignment-Analyse (EMBOSS Needle). SI und MGAM sind membrangebundene Glykoproteine vom Typ II, die effizient an der Apikalen- oder Mikrovillus-Membran der Enterozyten exprimiert werden.

Zu einer Kohlenhydrat-Malabsorption kommt es, wenn die unverdauten Disaccharide im Dünndarm von Bakterien im Dickdarm in kurzkettige Fettsäuren, CO2 und H2 umgewandelt werden. Dies führt zu Symptomen wie Bauchschmerzen, Blähungen, Flatulenz, Erbrechen und Krämpfen. Angeborener Sucrase-Isomaltase-Mangel (CSID) ist eine Form der Kohlenhydrat-Malabsorption, die durch Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in der kodierenden Region des SI-Gens ausgelöst wird. Wenn diese SNPs zu einer Verringerung der SI-Enzymaktivität führen, trägt dies zur Entwicklung des Reizdarmsyndroms (IBS) bei. Das Reizdarmsyndrom ist eine häufige funktionelle gastrointestinale Störung (FGID), die durch Bauchschmerzen und Veränderungen im Darmverhalten gekennzeichnet ist. Außerdem sind weltweit 10-15 % der Erwachsenen und Kinder vom Reizdarmsyndrom betroffen. Die Diagnose und Klassifizierung erfolgt gemäß den Konsensleitlinien von Experten, den Rom-Kriterien, auf der Grundlage wiederkehrender Symptome wie Bauchbeschwerden oder Schmerzen in Verbindung mit Durchfall (IBS-D), Verstopfung (IBS-C) oder gemischten Symptomen (IBS-M). Die Ätiologie des Reizdarmsyndroms ist unbekannt. Es wird jedoch angenommen, dass die Ernährung zu den Symptomen des Reizdarmsyndroms beiträgt. Zu den anerkannten Risikofaktoren gehören psychische Stressfaktoren, frühere Infektionen, Darmdysbiose, Dysfunktion der Epithelbarriere und mukosale Immunaktivierung. Epidemiologische Erhebungen und klassische Familien- bzw. Zwillingsuntersuchungen haben eine genetische Prädisposition gezeigt, aber die Identifizierung eindeutiger Anfälligkeitsgene ist nach wie vor schwer vorstellbar.

Die Rolle der Ernährung und diätetischer Faktoren wird beim Reizdarmsyndrom zunehmend anerkannt. Die Vermeidung von Kohlenhydraten aufgrund einer vermeintlichen Maldigestion ist weit verbreitet und eine Ernährung mit einem geringen Anteil an fermentierbaren Oligosacchariden, Disacchariden, Monosacchariden und Polyolen (FODMAPs, die im Dünndarm schlecht resorbiert werden) wurde als wirksame Maßnahme zur Verringerung der IBS-Symptome vorgeschlagen. Darüber hinaus werden wirksame zielgerichtete Therapien für das Reizdarmsyndrom durch die klinische Erkenntnis erschwert, dass die klinischen Symptome von Erwachsenen und Kindern mit Reizdarmsyndrom sowohl intra- als auch interindividuell stark variieren und im Laufe der Zeit schwanken.

Im ersten Teil der Dissertation wird die Interaktion zwischen SI und MGAM untersucht. Hierfür werden Extrakte der intestinalen Bürstengrenzmembran (BBM) verwendet, die in Lösung gebracht wurden. Durch reziproken Protein-Pull-Down, d.h. Immunpräzipitation mit Anti-SI-Antikörpern, gefolgt von Western Blotting mit Anti-MGAM-Antikörpern und umgekehrt, wird die Interaktion der beiden Proteine in einem Heterokomplex nachgewiesen. Zusätzlich wird die Widerstandsfähigkeit dieser Interaktion durch die Solubilisierung von BBMs mit Detergenzien einschließlich Triton X-100 (TX-100) und TX-100 in Kombination mit Natriumdeoxycholat (DOC) getestet. Es zeigt sich, dass die Aufnahme von DOC in den Puffer zu einer Verringerung der enzymatischen Aktivitäten gegenüber Saccharose und Maltose führt, was auf eine Veränderung der quaternären Struktur der beiden Enzyme zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pathophysiologie der Kohlenhydrat-Malabsorption bei funktionellen gastrointestinalen Störungen bei.

Im zweiten Teil wird die häufigste CSID-Variante in der grönländischen Inuit-Bevölkerung sowie SI-Varianten von IBS-Patienten untersucht. Bei 10 % der grönländischen Bevölkerung, die von dieser verkürzten Mutation betroffen sind, zeigt sich, dass SI^G92Lfs*8 trotz seiner Verkürzung und des Fehlens seiner katalytischen Untereinheiten Sucrase und Isomaltase an die Zelloberfläche transportiert wird. Zusätzlich wird ein heterozygotes Modell untersucht, das die Interaktion der Mutante mit dem Wildtyp SI aufzeigt und dazu führt, dass der Wildtyp die Inaktivität von SI^G92Lfs*8 kompensiert. Außerdem wird eine Reihe von Varianten von Patienten aus der UK Biobank analysiert. Dies ermöglicht uns, die Mutanten in 3 verschiedene Trafficking-Gruppen einzuteilen. Die erste ist die wildtypähnliche Gruppe, die die Eigenschaften des Wildtyps SI repräsentiert, mit Trafficking vom ER zum Golgi. Die zweite Gruppe ist die Gruppe des verzögerten Traffickings, bei der die Mutanten zwar zum Golgi transportiert werden, aber mit einer langsameren Geschwindigkeit. Die dritte Gruppe sind die ER-blockierten Mutanten, die nicht zum Golgi transportiert werden, sondern im ER verbleiben. Die Zelloberflächenaktivität dieser Mutanten wird dann mit Hilfe des experimentellen Ansatzes "Right Side Out Vesicles" analysiert, der an die Analyse von Biopsien angepasst ist. Die Ergebnisse zeigen die unterschiedlichen funktionellen Fähigkeiten der Mutanten, von denen einige mit ihren Trafficking-Mustern einhergehen und andere nicht. Darüber hinaus wird auch die Heterozygotie einiger dieser Mutanten bewertet. Durch Co-Transfektion zeigt das Heterozygotie-Modell die Interaktion der Varianten mit dem Wildtyp SI. Darüber hinaus zeigen die Aktivitäten in einigen Fällen die Kompensation des Wildtyps, während in anderen Fällen keine Veränderung durch die Interaktion erfolgt.