Bovine in vitro Embryo Production : Facing the Barriers from Various Perspectives

Im Reproduktionsmanagement von Rindern gewinnt die In-vitro-Embryonenproduktion (IVP) zunehmend an Bedeutung. Hierbei werden unreife Eizellen mittels Ovum-Pick-Up gewonnen und anschließend im Labor gereift, befruchtet und bis zum Blastozystenstadium kultiviert. Die Ausbeute an Embryonen aus in vitro gereiften Eizellen ist allerdings reduziert und nach Transfer auf Empfängertiere wird im Vergleich zu in vivo erzeugten Embryonen eine höhere Inzidenz an Trächtigkeitsverlusten beobachtet. Um den Prozess der In-vitro-Embryonenproduktion bei Rindern zu verbessern, haben wir drei Strategien verfolgt, die auf die einzelnen Schritte des IVP-Prozesses abzielen: Kompetenz und Reifung der Eizellen, Aufbereitung der Spermien und Verbesserung des Embryokulturmediums. In der ersten Studie lag der Fokus auf der zytoplasmatischen Eizellreifung. Hierfür wurden die Proteinexpressionsmuster von unreifen und in vitro gereiften Eizellen, welche aus Schlachthofmaterial gewonnen wurden sowie von in vivo gereiften Eizellen mittels Massenspektrometrie analysiert und verglichen. Insgesamt konnten 1.208 Proteine nachgewiesen werden, von denen 165 in mindestens einem der drei Gruppenvergleiche differenziell exprimiert waren. In vitro gereifte Eizellen zeigten nicht nur ein heterogeneres Proteinexpressionsprofil, sondern auch eine erhöhte Translationsaktivität im Vergleich zu in vivo gereiften Eizellen. Interessanterweise war zudem das Proteinmuster von in vivo gereiften Eizellen dem von unreifen Eizellen ähnlicher als dem von in vitro gereiften. Diese ausgeprägten Unterschiede im Proteinexpressionsmuster zwischen in vitro gereiften Schlachthof-Eizellen und in vivo gereiften Eizellen könnten sehr gut die geringere Entwicklungskompetenz von in vitro gereiften Eizellen erklären. Die zweite Studie konzentrierte sich auf die Spermienselektion in Vorbereitung auf In- vitro-Fertilisation. Eine neuartige Methode zur Spermienaufbereitung, der VetCount™ Harvester, wurde auf seine Funktionalität getestet. Hierfür wurde die Rückgewinnungsrate an Spermien, Qualitätsparameter (Motilität, Morphologie, Akrosomenintegrität, Membranfluidität, intrazelluläre Kalziumkonzentration und DNA-Integrität) und die Befruchtungsfähigkeit der Spermien erhoben und mit dem diskontinuierlichen BoviPure™-Gradienten, einer Standardtechnik zur Spermienselektion, verglichen. Zwar ist der VetCount™ Harvester fähig, eine qualitativ gute, befruchtungsfähige Spermienfraktion aus aufgetautem Bullensperma zu selektieren, aufgrund der geringen Konzentration der isolierten Spermienfraktion ist diese Methode aber keine Alternative für den Standardeinsatz in kommerziellen IVP-Zentren. Im dritten Projekt untersuchten wir, ob sich das Peptid „Preimplantation Factor“ (PIF) positiv auf die Embryonalentwicklung in vitro auswirkt. Hierfür wurden verschiedene Konzentrationen von synthetischem PIF-Peptid einem suboptimalen Embryokulturmedium zugesetzt und die Blastozystenrate, das Entwicklungsstadium sowie die Qualität der Embryonen evaluiert. Zusätzlich wurde getestet, welche Auswirkung das Entziehen von endogenem PIF durch Zugabe eines spezifischen PIF-Antikörpers zum Kulturmedium auf die Entwicklung der Embryonen hat. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass das PIF-Peptid keine direkte förderliche Wirkung auf die In-vitro-Embryonenentwicklung von Rindern hat. Letztendlich lässt sich aus den Ergebnissen aller drei Projekte ableiten, dass der vielversprechendste Ansatz zur Verbesserung der In-vitro-Embryonenproduktion darin liegt, den Fokus auf die Eizellenkompetenz und -reifung zu legen.