Cross-species evaluation of Pan-RAF inhibitor LY3009120 or SOS1::KRAS inhibitor BI-3406 in human, canine, and equine malignant melanoma

Gao, Yu

DissertationCC BY-NC-SA 4.02024Published

Cross-species evaluation of Pan-RAF inhibitor LY3009120 or SOS1::KRAS inhibitor BI-3406 in human, canine, and equine malignant melanoma

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Sowohl bei Hunden als auch bei Pferden ist das maligne Melanom eines der problematischsten Hautkrebse. Derzeit gibt es nur wenige Daten aus der bekannten Hochdurchsatz-Sequenzierung bei Hunden und Pferden, wodurch es notwendig ist, den genetischen Hintergrund des malignen Melanoms zu identifizieren und charakterisieren. Zusätzlich ist der Mangel an Forschung und Therapeutika für gezielte Therapien sowie das Problem der Ausbildung von Resistenzmechanismen bei den bereits begrenzten Therapiemöglichkeiten anzugehen. Hunde gelten als eines der besten spontanen Tiermodelle für das humane Melanom, wodurch sie als ergänzende Forschungsmodelle fungieren sollten. Gleichzeitig hat die Erforschung geeigneter gezielter Therapien beim Menschen auch den Haustieren geholfen.

Um in diesem Zusammenhang neue therapeutische Möglichkeiten bei malignen Melanomen in Hunden und Pferden zu evaluieren und das Verständnis der genetischen Hintergründe des Melanoms zu vertiefen, wurden Hochdurchsatz-Sequenzierungen durchgeführt. Zum Vergleich wurden die humane Hautzelllinie A375 und die humane Aderhautmelanom-Zelllinie 92-1 verwendet. Während die humane Hautzelllinie A375 eine BRAF^V600E Mutation aufweist, handelt es sich bei der humanen Aderhautmelanom- Zelllinie 92-1 um einen Wildtyp des Hotspot-Gens BRAF. Des Weiteren wurde der Einsatz zielgerichteter Therapeutika, deren Wirksamkeit bei Menschen bekannt sind, untersucht. Bei den in der Therapie angewandten Inhibitoren handelte es sich um den KRAS-Inhibitor BI-3406 und den pan-RAF Inhibitor LY3009120.

Hierfür wurden dosis- und zeitabhängige zelluläre Reaktionen auf der Grundlage der Zellzahl und -morphologie, der Stoffwechselaktivität und der Apoptose/Nekrose untersucht. Darüber hinaus wurden SNV-Sequenzen analysiert, die zu humanen Hotspot-Onkogenen gehören könnten.

Die Ergebnisse zeigten zusammenfassend, dass insgesamt drei Zelllinien Mutationen aufwiesen bei Pferden und Hunden: MelDuWi EMM-Zelllinie mit einer KRAS p.Q61H-Mutation, die bestrahlungsresistente cRGO1.2 Hundemetastasen-Zelllinie mit einer NRAS p.G13R-Mutation, und die cRGO1 Hundemelanom-Zelllinie mit einer NRAS p.G13R-Mutation.

Der SOS1::KRAS Inhibitor BI-3406 konnte keine inhibierende Wirkung auf die Hunde- und Pferde-Melanom-Zelllinie zeigen. Der pan-RAF Inhibitor LY3009120 konnte jedoch, mit Ausnahme der metastasierenden eRGO6 Wildtyp-Pferdemelanom-Zelllinie, zu einer antitumoralen Wirkung bei den weiteren Hunde- und Pferde-Melanom-Zelllinien führen, die sich durch signifikante Abnahme der Biomasse, der Zellproliferation und der Stoffwechselaktivität sowie in einer Zunahme der Apoptose und der Induktion zellulärer Morphologieveränderungen äußerten.

Zusammenfassend konnten für das metastasierende Melanom drei Zelllinien-Modelle (cRGO1.2, cRGO6 und eRGO6) identifiziert werden, mit deren Hilfe die Resistenzbildung gegenüber des pan-RAF Inhibitors LY3009120 untersucht werden kann. Durch die biologische Wirksamkeit des pan-RAF Inhibitors LY3009120, wäre dies eine Möglichkeit zur Behandlung von Melanom bei Hunden und Pferden. Dadurch sollte die Anwendung und Wirkung des pan-RAF Inhibitors LY3009120 in weiteren Ex-vivo-Studien untersucht werden. Außerdem reagieren Melanomzelllinien von Hunden und Pferden ähnlich auf Medikamente wie menschliche Zelllinien, sodass das die Idee unterstützt, dass Melanomzelllinien von Hunden oder Pferden als Modell für menschliche Melanom verwendet werden können.

The development of treatment in human cancers are benefited from the excellent comparative oncology models, the same goes for companion animals. However, the development of targeted therapy drugs in canine and equine melanoma is limited. The treatment review of canine and horse melanoma was described in Manuscript 3 and 4. Further, the application of the targeted pan-RAF inhibitor (LY3009120) to human melanoma has yielded promising results in various studies. LY3009120, known for its potency as a pan-RAF and RAF dimer inhibitor and inducing minimal paradoxical activation, has demonstrated significant anti-cancer effects across different cancer types. LY3009120 has exhibited inhibitory effects on a wide range of cancer cell lines, including those with RAF/RAS mutations and wild-type. These findings underscore the therapeutic potential of LY3009120 as a promising treatment option for melanoma, highlighting its importance in targeted cancer therapy research. However, the potential of LY3009120 in canine and equine has not been evaluated. What is more, there are no experimental reports or clinical trials that evaluated the use of PRi in canine and equine melanoma. Given the similarity and importance of the Ras-Raf-MEK-ERK signal transduction cascade pathways regulates the pathogenesis of melanoma in the three species. Therefore, more understanding of the genetic background of melanoma in cross-species and more feasible treatment options should be considered for CMM and EMM.

In our study, we comparatively analyzed the presence of potentially pathogenic SNVs (BRAF, NRAS, KRAS, and KIT) in eleven MM cell lines through Sanger sequencing and/or WES (described in Manuscripts 1 and 2). Moreover, we comparatively assessed the treatment response/non-response of LY3009120/BI-3406 in human, canine, and equine MM in vitro models (including RAF/RAS mutant or wild-type melanoma cell lines) (LY3009120 applications were described in Manuscripts 1 & 2). We shed light on their behavior, drug response, and genotype-related differences. These findings contribute to a deeper understanding of the limited genetic background of potentially pathogenic SNVs and the therapeutic potential of LY3009120 in canine and equine melanoma. Furthermore, the study highlighted the significance of proto-oncogene mutations and similarities in cellular response with human melanoma cell lines (A375 and 92-1). Similar tumor features were found in three cross-species samples: such as proto-oncogene mutation and the significant anti-tumor effect of the cell biomass, metabolic, proliferative, apoptotic, and necrosis outcomes when compared with the human melanoma cell line (A375) in LY3009120. Except for metastases-derived eRGO6, LY3009120 showed the anti-proliferation and anti-biomass effect on all melanoma cell lines independent of the molecular BRAF and RAS mutational status in the study. RAS^mut cells were more sensitive to LY3009120 than wild-type cells in both equine and canine metabolic activity. Now, as research continues to show similarities and differences in the genetic mutation background, tumorigenesis pathways, and drug response in human, equine, and canine melanoma, this evidence provides a direction for targeted therapeutics strategy of melanoma: the potential for utilizing targeted therapeutics developed for one species in the management of melanoma across different species. Our study of RAS^mutand wild types in canine and equine melanoma cell lines is of significance, which enriches the genetic background for the application of human-targeted drugs in canine and equine and increases the feasibility of canine and equine as models of human melanoma. Since the RAS^mut and WT canine and equine melanoma cell lines in this study are sensitive to LY3009120 suggests the potential value of LY3009120 in clinical trials in canine and equine melanoma. Based on DNA sequencing and cellular response, we significantly found typical cell models (cRGO1, cRGO1.2, cRGO6, MelDuWi, and eRGO6) that respectively represent the NRAS p.G13R-mutation primary COM, NRAS p.G13R-mutation metastatic and irradiation-resistant COM, RAF/RAS^WTcutaneous metastatic CMM, KRAS p.Q61H-mutation equine primary EMM, and RAF/RAS^wt drug-resistant EMM for further comparative oncology research. We found that SOS1::KRAS inhibitor BI-3406 is ineffective against canine and equine MM cell lines. It is worth further underscoring the relevance of the Ras-Raf-MEK-ERK signaling cascade pathways in melanoma pathogenesis, prognosis, and resistance across these species in the future.

This advancement in targeted therapies for humans, canine, and equine MM cell lines not only advances veterinary medicine but also may provide potential cancer models and insights for human oncology. As our comprehension of the tumor alteration feature of canine and equine MM expands, targeted treatment of specific inhibitor may emerge as a promising avenue for enhancing treatment effectiveness in dog and horse melanomas.