When Hypnos meets Thanatos: emergence, diagnostics, pathophysiological and immunological consequences of “koi sleepy disease” caused by carp edema virus infection of common carp in Europe

Adamek, Mikolaj

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When Hypnos meets Thanatos : emergence, diagnostics, pathophysiological and immunological consequences of “koi sleepy disease” caused by carp edema virus infection of common carp in Europe

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Die in dieser Arbeit zusammengestellten Studien veranschaulichen die Auswirkungen einer Karpfenödem-Virusinfektion (engl. Carp edema virus, CEV) und der durch diese Infektion verursachten Koi-Schlafkrankheit bei Karpfen (engl. Koi sleepy disease, KSD). Hierzu gehört der erste dokumentierte Nachweis des Virus bei Karpfen in mehreren Ländern auf dem europäischen Festland. Die Existenz des Virus wurde in Deutschland, Ungarn, Serbien, Kroatien und der Ukraine bestätigt, wo es zu Verlusten in Karpfen-Aquakulturen führte. Bestätigt wurden eine hohe Prävalenz des Virus und sein Zusammenhang mit bestimmten klinischen Symptomen sowie die Saisonabhängigkeit der Krankheitsausbrüche. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen CEV-Varianten und Virulenz hergestellt. Um der Ausbreitung des Virus besser entgegenzuwirken, wurden die Herausforderungen bei der Diagnose ätiologischer Erreger von Kiemenkrankheiten bei Karpfen erörtert und ein neuartiger Ansatz zur Durchführung einer Differenzialdiagnose bei Vorhandensein weiterer Kiemen-befallender Erreger aufgezeigt.

Weiterführende Forschung zeigte, dass CEV die Entwicklung von bakteriellen Sekundärinfektionen in den Kiemen fördern kann, die durch Flavobacterium branchiophilum verursacht werden, einem bekannten Erreger von Kiemenkrankheiten. Sowohl in Proben aus experimentellen Infektionen als auch in Feldproben korrelierte die in den Kiemen nachgewiesene Häufigkeit von Flavobakterien stark mit der Viruslast. Dies ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass CEV die Schleimhautbarrieren beeinträchtigt. Wir konnten zeigen, dass die Ursache für die Entwicklung von Sekundärinfektionen mit der Herunterregulierung der Expression von Muzinen auf der Mucosa der Kiemen unter CEV-Infektion zusammenhängen könnte. Da diese Schleimschicht für den immunologischen Schutz der Fische äußerst wichtig ist, kann eine Herabregulierung der Muzine einer der Gründe für bakterielle Sekundärinfektionen sein, die CEV bei Ausbrüchen von KSD begleiten.

Wir brachten die Beeinträchtigung verschiedener physiologischer Prozesse, die von den Kiemen gesteuert werden, einschließlich des Sauerstoff- und Kohlendioxidaustauschs, des Wasser- und Ionentransports sowie der Ausscheidung von Ammoniak, mit der Entwicklung klinischer Symptome und der Sterblichkeit während der CEV-Infektion in Verbindung. Es wurde eine umfassende Analyse der physiologischen, metabolischen und teilweise immunologischen Reaktionen von Karpfen auf die Infektion durchgeführt. Die aus einer Metabolom-Analyse des Blutplasmas gewonnenen Daten unterstreichen, dass der Karpfen als relativ hypoxie-unempfindlicher Fisch die verringerte Sauerstoffaufnahme, welche mit einem Verlust der funktionellen Kiemenoberfläche oder einer erhöhten Diffusionsdistanz zwischen Umgebungswasser und Blutplasma einhergeht, durch metabolische Anpassungen kompensieren kann. Dies schließt eine Verringerung energieaufwändiger Prozesse, wie des Nukleotidstoffwechsels, mit ein. Im Gegensatz dazu war die CEV-Infektion mit einer schweren Störung der Ammoniakausscheidung und der Ionenhomöostase in KSD-befallenen Koi verbunden, welche nicht kompensiert werden konnten.

Die pathophysiologische Belastung durch Hyponatriämie und Hyperammonämie verursacht das komatöse (schläfrige) Verhalten, welches bei der Koi-Schlafkrankheit zu beobachten ist, und führt außerdem zu einer Unterdrückung der T- und B-Zell-Immunreaktionen. Diese Unterdrückung der adaptiven Immunantwort kann zusätzlich dazu beitragen, die Entstehung von Sekundärinfektionen zu erleichtern. Ein zunehmender Schweregrad der klinischen Symptome führt dann zum Tod CEV-infizierter Tiere. Die klinischen Anzeichen von KSD, der Ammoniakgehalt und die Ionenverluste könnten durch eine Ergänzung des Umgebungswassers mit Natriumchlorid behoben werden.

Auf der Grundlage der hier vorgestellten Daten wird spekuliert, dass Krankheiten der Atmungsorgane die Fische hauptsächlich durch eine Störung der komplexen Austauschprozesse des Ionentransports, der Stickstoffausscheidung und des Säure-Basen-Gleichgewichts beeinträchtigen, und nicht, wie bisher angenommen, durch Induktion einer Hypoxie. Hervorzuheben ist, dass unsere Daten es uns ermöglichen, die Störung der physiologischen Prozesse mit der Immunsuppression in Verbindung zu bringen, welche in KSD-erkrankten Exemplaren beobachtet wird. Dies dokumentiert komplexe Pathogen-Wirt- Interaktionen, die bisher in Fischen nicht untersucht wurden. Abschließend sollen die wichtigsten klinischen Anzeichen der KSD veranschaulicht werden, indem wir auf ein Treffen zweier Brüder aus der griechischen Mythologie zurückgreifen - Hypnos, den Gott des Schlafes und Thanatos, den Gott des Todes, da im drastischen Krankheitsverlauf der KSD beim Karpfen sehr oft, und zum Unglück des Wirtes, der Schlaf auf den Tod trifft.

The studies compiled in this work, illustrate the impact of a carp edema virus infection and of koi sleepy disease, caused by this infection in common carp. This includes the first documented detection of this virus in common carp in several countries in continental Europe. The presence of the virus was confirmed in Germany, Hungary, Serbia, Croatia and Ukraine where it was inducing losses in common carp culture. Confirmed was a high prevalence of the virus and its association with certain clinical signs as well as the seasonality of the disease outbreaks. Furthermore, an association between CEV variants and virulence was putatively established. To better counteract the spread of the virus, the challenges of diagnosing etiological agents of gill diseases in carp were discussed and a novel approach to performing a differential diagnosis in the presence other pathogens affecting gills was shown.

The further research showed that CEV can promote the development of secondary bacterial infections in gills caused by Flavobacterium branchiophilum, which is a known pathogen inducing gill diseases. Both in experimental infections as well as in field samples the abundance of flavobacteria detected in gills was strongly correlated with the virus load. This was a significant indicator that CEV compromises the mucosal barriers. We showed that the cause for a development of secondary infections could be linked to the downregulation of the expression of mucins in gills under CEV infection. As the mucus layer is extremely important for the protection of fish, a downregulation of mucins can be one of the reasons for secondary bacterial infections accompanying CEV during outbreaks of KSD.

We linked the impairment of various physiological processes governed by gills, including oxygen and carbon dioxide exchange, water and ion transport, as well as the excretion of ammonia, with the development of clinical signs and mortality during CEV. A comprehensive analysis of physiological, metabolic and partial immunologic responses of carp to the infection was performed. The data obtained from a metabolome analysis of blood plasma underlined that carp as a moderately hypoxia insensitive fish can compensate the reduction in oxygen uptake related with a loss of functional gill surface or increased diffusion distance between environmental water and blood plasma by metabolic adaptations, including a reduction in energy demanding processes such as nucleotide metabolism. In contrast to the ability of carp to perform a metabolic compensation of reduced oxygen supply related to branchial pathology, the CEV infection was associated with a severe disturbance of ammonia excretion and the ionic homoeostasis in KSD-affected koi. Differently to terrestrial animals, which mainly regulate the ionic homoeostasis via the kidney, in most fish species the gills are the main osmoregulatory organ with minor contributions from the intestine and the kidney.

The pathophysiological distress of hyponatremia and hyperammonemia cause the comatose (sleepy) behavior observed during koi sleepy disease, and also cause a suppression of T and B cell immune responses. This suppression of adaptive immune responses can be an additional contributor to ease the development of secondary infections. Increasing severity of clinical signs subsequently will lead to the death of the CEV-infected animals. Clinical signs of KSD, ammonia levels and ion losses could be solved by supplementing the tank water with sodium chloride. On the basis of the data presented here, we therefore speculate that branchial diseases affect fish mainly by a disturbance of the complex branchial processes of ion transport, nitrogen excretion and acid-base balance rather than by an induction of hypoxia. Importantly, our data allow us to link the disturbance of physiological processes to the immunosuppression observed in specimens suffering from KSD. This documents complex host-pathogen interactions, which previously had not been addressed in fish. Finally, we attempt to illustrate the main clinical signs of KSD by reverting to a meeting of two brothers from Greek mythology – Hypnos, the god of sleep and Thanatos, the god of death, as very often and very unfortunate for the host, sleep meets death during the drastic form of KSD in common carp. The CEV infection and the development of KSD illustrate the unique importance of the gills for fish survival and the unprecedented impact of gill diseases on the survival of the fish.