Insights into canine uterine inertia in the dog: – the relevance of myometrial function and contractility

Jungmann, Carolin

Dissertation 2024 CC BY 4.0

Published

Insights into canine uterine inertia in the dog : – the relevance of myometrial function and contractility

German
English

Obwohl Hunde mit zu den weitverbreitetsten Haustieren gehören und Menschen sie seit vielen Jahrhunderten züchten, ist das Wissen über die Geburt der Hündin und die damit verbundenen physiologischen Vorgänge immer noch sehr gering. Demzufolge ist auch nur wenig über die Ätiologie der primären Wehenschwäche (PUI) bekannt, obwohl es sich dabei um die häufigste Ursache für Dystokie bei der gebärenden Hündin handelt. Prostaglandine, allen voran Prostaglandin F2α (PGF2α), sind beim Hund maßgeblich an der geburtseinleitenden Signalkaskade beteiligt. Der individuelle Effekt von PGF2α auf das myometriale Kontraktionsverhalten ist jedoch kaum untersucht. Neben PGF2α gibt es noch eine Reihe weiterer kontraktionsassoziierter Proteine (CAPs), dazu gehören die Prostaglandinsynthase‑2 (PTGS2) sowie die Rezeptoren für Oxytozin and PGF2α (OXTR und PTGFR). Oxytozin ist ein stark uteroton wirkendes Neuropeptid, das aus der Neurohypophyse als Antwort auf einen vaginalen Dehnungsreiz freigesetzt wird, wenn ein Welpe in den Geburtskanal eintritt. Im Hinblick auf die Komplexität dieses Zusammenspiels war eine Hypothese dieser PhD-Arbeit, dass eine veränderte Expression dieser CAPs an der Entstehung von caniner Wehenschwäche beteiligt sein könnte. Da P4 als trächtigkeitserhaltendes Hormon für die Ruhigstellung des Uterus verantwortlich ist, könnte zudem eine dysfunktionale Regulation der Progesteron- (P4) Synthese und der Expression des entsprechenden Rezeptors (PGR) kausal für das Fehlen von myometrialen Kontraktionen bei PUI zugrunde liegen. Ziel dieser PhD-Arbeit war es, die Expression von OXTR, PTGFR und PGR auf Protein- und Gen-Ebene zu untersuchen, wobei die Expression jeweils zwischen Hündinnen mit PUI und obstruktiver Dystokie (OD) verglichen wurde. Außerdem wurde erstmalig die Kontraktilität von isoliertem caninen trächtigen Myometrium anhand interplazentarer Proben untersucht. An den während medizinisch indizierter Kaiserschnitte entnommen Proben wurden die individuellen Reaktionen der longitudinalen und zirkulären Schicht des Myometriums auf Stimulation mit Oxytozin, PGF2α und Denaverinhydrochlorid studiert. Diese Substanzen wurden aufgrund ihrer postulierten uterotonen Effekte ausgewählt.

Während sich die Serum P4-Konzentrationen zwischen den Gruppen nicht unterschieden, zeigten die PUI-Proben verglichen mit OD eine signifikant höhere mRNA-Expression sowohl für OXTR als auch PGR. Diese Beobachtung galt für interplazentare, aber nicht für uteroplazentare Proben. Weiterhin wurde versucht, die PTGFR und PTGS2 mRNA-Expression in den separierten Myometriumsschichten zu untersuchen, wobei auf Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Proben zurückgriffen werden musste. Während sich die PTGS2-Expression weder zwischen den Schichten noch zwischen den Gruppen (PUI und OD) unterschied, gelang die Quantifikation der PTGFR-Expression am Probenmaterial nicht. Auf Proteineben konnten mittels Immunhistochemie keine signifikanten Unterschiede in der Expression von OXTR, PTGFR und PGR zwischen den Dystokie-Gruppen festgestellt werden. Da die Wurfgröße im Zusammenhang mit der Entstehung einer Wehenschwäche stehen könnte, wurde die OXTR- und PGR-Expression zusätzlich hierauf untersucht. Die nachgewiesene signifikant niedrigere PGR-Expression im Zusammenhang mit für die entsprechende Rasse überdurchschnittlich großen Würfen bestätigt einen möglichen Zusammenhang. Weiterhin differierten OXTR- und PTGFR-Proteinexpression zwischen beiden Myometriumsschichten mit einer jeweils signifikant höheren Expression in der zirkulären verglichen mit der longitudinalen Schicht. Diese Beobachtung stimmt mit den Ergebnissen aus dem Organbad überein, in dem schichtspezifische Unterschiede bei der Stimulation mir Oxytozin (1 nM, 10 nM, 100 nM) und PGF2α (50 pM, 0.5 µM, 50 µM) beobachtet wurden. Allgemein war die Antwort des Gewebes auf Stimulation mit Oxytozin in der zirkulären Schicht stärker ausgeprägt. Hohe Konzentrationen an Oxytozin verursachten in der longitudinalen Schicht eine verlängerte, tonische Kontraktion; im Anschluss war die longitudinale Muskelschicht nicht weiter responsiv für Oxytozin. Nur bei Stimulation mit 1 nM Oxytozin erfolgte eine vergleichbare Zunahme der Kontraktilität in beiden Schichten. Hinsichtlich PGF2α konnte ausschließlich in einer supraphysiologisch hohen Dosierung (50 µM) ein signifikanter Effekt induziert werden. Dieser war jedoch auf die zirkuläre Myometriumsschicht beschränkt, während die longitudinale Schicht des Myometriums keine nachweisbare Reaktion zeigte. Denaverinhydrochlorid zeigte im Organbad weder alleine noch nach vorheriger Oxytozin-Gabe einen Effekt auf das Kontraktionsverhalten.

Die lokalen, interplazentaren PGF2α-Konzentrationen korrelierten negativ mit der peripheren Serum P4-Konzentration. Des Weiteren waren die interplazentaren PGF2α-Konzentrationen in Proben „in der Geburt“ (während der präpartaler Luteolyse) signifikant höher als in antepartalen Proben, was eine interplazentare PGF2α-Produktion bestätigt. Interessanterweise waren die lokalen PGF2α-Konzentrationen in Proben von Hündinnen mit PUI signifikant niedriger als in Proben von Hündinnen in Geburt; de facto glichen die Konzentrationen bei PUI-Geweben eher denen von Hünndinen kurz vor Geburtsbeginn (vor der präpartaler Luteolyse).

Bei Betrachtung aller Ergebnisse ließ sich die initiale Hypothese einer reduzierten OXTR- und PTGFR-Expression bei PUI nicht bestätigen. Eine erhöhte PGR-Expression, die möglicherweise in einer verstärkten Wirkung des verbliebenen P4 resultiert, könnte jedoch bei PUI eine Rolle spielen, wenngleich die Bedeutung der verschiedenen PGR-Isoformen noch weiter untersucht werden müsste. Die in vitro Kontraktilitätsversuche deuten auf eine deutlichere OXTR-Desensibilisierung in der longitudinalen Myometriumsschicht infolge einer Stimulation mit hohen Oxytozindosierungen hin, was möglicherweise die höhere OXTR-Expression in der zirkulären Schicht erklärt. Die Rezeptordesensibilisierung ist eine bekannte Reaktion G-Protein gekoppelter Rezeptoren, zu denen auch OXTR und PTGFR gehören. Im Hinblick auf diese ligandenabhängige Desensibilisierung scheint es möglich, dass die hohen PGF2α-Konzentrationen während der Luteolyse ebenfalls zu einer Desensibilisierung der Rezeptoren und damit zu einer verringerten Ansprechbarkeit auf weitere PGF2α-Stimulationen während der Geburt führen, und so die geringe Wirkung im Organbad bewirken könnten.

Obwohl die Ergebnisse dieser PhD-Arbeit keine finalen Antworten auf die Frage nach der Ätiologie der caninen PUI geben können, so liefern sie doch einen wichtigen Beitrag zu deren Klärung und geben einen umfangreichen Einblick in die Physiologie caniner myometrialer Funktion und Kontraktilität. Weitere Forschung ist notwendig, um die Bedeutung meiner Ergebnisse aufzuzeigen, das Wissen über die Geburt bei Hunden zu verbessern und die komplexe Ätiologie von PUI zu klären, aber auch, um neue und optimierte Behandlungsmöglichkeiten neben der Operation, dem Kaiserschnitt, zu finden.

Although dogs are among the most popular pets and we have been breeding them for hundreds of years, knowledge of canine parturition and birth-related physiology is still very limited. Accordingly, very little is known about the etiology of canine primary uterine inertia (PUI), the most common cause of dystocia in the periparturient bitch. Prostaglandins, especially PGF2α, play an important role in the signaling cascade initiating canine labor, but their effects on myometrial contractility remain unknown. Besides PGF2α, a collective of further contraction-associated proteins (CAPs), including prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) as well as the receptors for PGF2α (PTGFR) and oxytocin (OXTR), are involved in the switch to a contractile myometrial state. Oxytocin is a strong uterotonic nonapeptide hormone that is released from the pituitary in response to vaginal pressure when a puppy enters the birth canal. Keeping in mind the necessity of functioning interplay of these factors, one hypothesis of this PhD thesis was that altered expression of the above-mentioned CAPs might be involved in PUI. Additionally, dysfunctional regulation of progesterone (P4) synthesis and the expression of its receptors (PGR) could be responsible for the lack of myometrial contractions in PUI, as P4, the pregnancy maintaining hormone, prevents myometrial activity. The aim of this thesis was also to investigate the expression of OXTR, PTGFR and PGR at protein and gene levels, comparing samples from bitches suffering from PUI or obstructive dystocia (OD). Moreover, for the first time the contractility of isolated canine pregnant myometrium was analyzed. Using interplacental samples obtained during medically indicated Cesarean sections, the respective responses of the individual layers (longitudinal and circular layer) following stimulation with oxytocin, PGF2α, and denaverine hydrochloride were assessed. These drugs were selected because of their postulated uterotonic effects, activating myometrial contractions. While serum P4 levels did not differ between groups, significantly higher mRNA expression in PUI compared to OD for both OXTR and PGR, in interplacental, but not uteroplacental samples was identified. Attempts were made to determine PTGFR and PTGS2 mRNA expression in separated myometrial layers derived from formalin-fixed paraffin-embedded samples. However, while PTGS2 expression did not differ between layers and groups (PUI vs. OD), quantification of PTGFR expression was not possible. In immunohistochemistry, no significant differences of OXTR, PGR and PTGFR expression could be identified between dystocia groups. As an impact of litter size was postulated in PUI, further analysis of OXTR and PGR expressions in regard to different litter sizes showed significantly reduced PGR expression in litters larger than average breed‑specific litter sizes. Moreover, layer-specific expression alterations were identified at protein level, with OXTR and PTGFR expression being significantly higher in the circular myometrial compared to the longitudinal layer. Similarly, following stimulation with different concentrations of oxytocin (1 nM, 10 nM, and 100 nM) and PGF2α (50 pM, 0.5 µM, and 50 µM), layer-specific responses were observed in an in vitro organ bath approach. The myometrial contractile response to all oxytocin concentrations was generally stronger in the circular layer. However, high oxytocin concentrations induced a prolonged tonic contraction followed by unresponsiveness of the longitudinal layer. Only 1 nM oxytocin successfully induced myometrial contractions in both layers. A response to PGF2α stimulation was restricted to a supraphysiologically high dosage (50 µM) and the circular layer, whereas the longitudinal layer showed no response to stimulation. Denaverine hydrochloride exerted no significant effect on myometrial contractility, neither alone nor on contractions induced by oxytocin. Comparison of local interplacental PGF2α and serum P4 concentrations identified a negative correlation between both hormones. Uterine PGF2α tissue concentrations were significantly higher during prepartum luteolysis compared to “not in birth” samples, confirming the interplacental tissue as production site of PGF2α. Interestingly, local PGF2α concentrations in samples from PUI bitches were significantly lower compared to those during prepartum luteolysis, but resembling more concentrations measured in “not in birth” samples.

Taking all results into consideration, the initial hypothesis of reduced OXTR and PTGFR expression in PUI could not be confirmed. Increased PGR expression and thus an enhanced effect of the remaining P4 might be involved in the etiology of PUI, although the role of the different PGR isoforms remains to be investigated. The in vitro contractility studies point to a more pronounced OXTR desensitization in the longitudinal layer following high dose stimulation, possibly explained by higher OXTR expression in the circular myometrial layer. Desensitization is a well described reaction of G-protein coupled receptors to which both OXTR and PTGFR belong. With respect to a possible ligand-dependent desensitization, it seems plausible that PGF2α signaling during prepartum luteolysis renders the PTGFR less responsive to further PGF2α stimulation during labor, explaining the low responsiveness in the organ bath.

Although the results of this PhD thesis do not allow for final conclusions to be drawn concerning the etiology of canine PUI, they provide important insights into the physiology of canine myometrial function and contractility. Further research is necessary to demonstrate the implications of these findings in order to improve our knowledge on canine parturition, thus clarifying the complex etiology of PUI, but also to identify new and optimized treatment options in addition to surgery.