impact of Influenza A virus triggered neutrophil extracellular traps on bacterial co-infectionsThe

Lassnig, Simon

DissertationAll rights reserved2024Published

The impact of Influenza A virus triggered neutrophil extracellular traps on bacterial co-infections

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Das Influenza A virus(IAV) ist ein Infektionserreger, der den Respirationstrakt von Vögeln und Säugetieren, insbesondere von Menschen und Schweinen infiziert. Die Erkrankung geht für gewöhnlich mit Fieber und respiratorischen Symptomen einher. Durch die Infektion und die erzeugte Immunantwort des Wirtes laufen in der Lunge Prozesse ab, die die Anfälligkeit des Wirtes für eine bakterielle Sekundärinfektion stark erhöhen. Dadurch sind bei epidemischen Wellen und den pandemischen Ausbrüchen des 20. Jahrhunderts ein Großteil der Todesfälle bakteriell ausgelösten Lungenentzündungen zuzurechnen. Vertreter der Pasteurellaceae gehören zu den am häufigsten ko‑infizierenden Bakterien bei IAV-Infektionen. Die wichtigsten Arten sind Haemophilus (H.) influenzae im Menschen und Glaesserella (G.) parasuis sowie Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp) beim Schwein. Während einer IAV-Infektion kommt es zu einer starken Infiltration von Neutrophilen Granulozyten, einem Bestandteil des angeborenen Immunsystem. Neben mehreren potenten Effektorfunktionen zur Bekämpfung von Krankheitserregern, können Neutrophile ihr Chromatin als neutrophile extrazelluläre Netze (NETs) ausschleusen, um Erreger zu fangen und zu töten. Vertreter der Pasteurellaceae können die Wirkung von NETs überleben und sich nach deren Degradierung von deren Abbauprodukten ernähren. In dieser Studie wurde die Interaktion von Pasteurellaceae des Menschen und des Schweins, namentlich H. influenzae, G. parasuis und A.pp mit NETs untersucht, die selbst oder durch eine vorherige IAV-Infektion erzeugt wurden.

Hierfür wurden in vitro, ex vivo und in vivo Methoden in Kombination mit Immunfluoreszenzmikroskopie und kolorimetrischen Nachweismethoden für NETs verwendet. Im ersten Teil dieser Studie wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass G. parasuis in vitro NETs in Neutrophilen des Schweins induziert, die antimikrobielle Wirkung übersteht und sich nach deren Degradierung von der frei werden DNA und Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) ernährt und somit einen Wachstumsschub erfährt. Im zweiten Teil dieser These wurden Lungenspülproben (BALF) von Schweinen mit einer natürlichen IAV-Infektion auf NETs untersucht und zum ersten Mal die Bildung von vesikulären NETs bei IAV beschrieben. In in vitro Experimenten wurde gezeigt, dass die BALF-Proben von IAV infizierten Schweinen einen wachstumsfördernden Effekt auf bakterielle Lungenerreger des Schweins haben. Als auslösende Inhaltstoffe konnten freie DNA, NAD und Sialinsäuren ausgemacht werden. Das inflammatorische Milieu in der BALF konnte porcine Neutrophile nicht bei der Eliminierung von A.pp unterstützen. Im dritten Abschnitt dieser Arbeit wurde in einem Tierversuch eine experimentelle Ko-Infektion mit einem humanen IAV-Isolat und H. influenzae in der Maus durchgeführt. Hierbei wurde der zeitliche Verlauf der Infektion charakterisiert und es konnte gezeigt werden, dass durch die vorangegangene IAV-Infektion die bakterielle Ko-Infektion verstärkt wurde. Im zeitlichen Verlauf stieg die Menge an NETs in der Lunge an und korrelierte stark mit den histologischen Schäden im Lungengewebe. Ebenso stieg die Aktivität der DNase1 kontinuierlich an. Die in diesem Studienabschnitt gewonnenen Daten ermöglichen es in zukünftigen Tierversuchen Therapeutika zu testen, die die Bildung von NETs beeinflussen. Der Fokus liegt hier auf DNase, um den Vorteil der Degradierung der NETs mit dem nachteiligen Effekt der erhöhten Nährstoffverfügbarkeit abzuschätzen.

Die Ergebnisse aus dieser Arbeit tragen dazu bei, die komplizierten Prozesse in der Wirt-Erreger-Interaktion bei respiratorischen Erkrankungen besser zu verstehen und den Einfluss von NETs einzuschätzen.

Influenza A virus (IAV) is a pathogen that infects the respiratory tract of birds, and mammals especially humans and pigs. It causes a disease with respiratory symptoms and fever. The infection and the induced immune response severely increase the susceptibility of the host to a secondary bacterial pneumonia. Due to this, the majority of the deaths in seasonal epidemics and the pandemics of the past century were attributed to secondary bacterial pneumonia. Bacteria of the Pasteurellaceae belong to the most frequent co-infecting agents in IAV infections. The most important species are Haemophilus (H.) influenzae in humans and Glaesserella (G.) parasuis and Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp) in the pig. During an infection with IAV, a massive infiltration of neutrophil granulocytes is reported. Neutrophils are a part of the innate immune system and have a broad range of effector function to combat invading pathogens. One of these functions is the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils expel their chromatin to entrap and kill pathogens. H. influenzae and A.pp can survive the antimicrobial effect of NETs and feed on released growth factors that are released upon degradation of NETs. In this study, the interaction between human and porcine Pasteurellaceae bacteria, namely H. influenzae, G. parasuis and A.pp and NETs was investigated. The NETs were either directly induced by the bacteria or by an ongoing IAV infection. Therefore, a combination of in vitro, ex vivo and in vivo methods was used, in combination with immunofluorescence microscopy and colorimetric assays to detect NETs.

In the first part of this study the induction of NETs by G. parasuis was shown for the first time. Additionally, it could be shown that G. parasuis survives NET-mediated killing and is able to use DNA and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) that is released by the degradation of NETs. This increased the growth of G. parasuis. In the second chapter of this thesis bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of pigs naturally infected with IAV was investigated for NETs. For the first time, vesicular NET formation was described during an IAV infection. In vitro experiments showed that the BALF from IAV infected pigs had a growth-enhancing effect on lung pathogenic bacteria of the pig. As responsible substances, free DNA, NAD and sialic acids could be identified. The inflammatory milieu in the BALF samples did not enable porcine neutrophils to kill A.pp. In the third part of this study an experimental co-infection of a human IAV isolate and H. influenzae was conducted in the mouse model. The timeline of the infection was characterized, and it could be shown that the preceding IAV infection aggravated the bacterial co-infection. During the course of the disease, the amounts of NETs increased and correlated strongly with the observed lung lesions. Additionally, the activity of the host DNase1 gradually increased. The results of this study allow future studies to test therapeutic drugs that target the formation of NETs. Especially DNase is interesting, to clarify if the beneficial effects of degraded NETs outweigh the detrimental effects of an increased release of nutrients for bacteria.

The results of this project contribute to a better understanding of the complex processes of the host-pathogen-interaction of respiratory disease and which impact NETs have.