Dietary modulation of FGF23/Klotho signal pathway in young goats
Weltweit steigt die Nachfrage nach Nahrungsmitteln aus tierischen Erzeugnissen mit gleichzeitig begrenzter Menge an Weide- und Anbauflächen. Diese Faktoren sind prädestiniert für einen zukünftigen Mangel an Stickstoff (N) und somit Rohprotein in Futtermitteln. Hinzu kommt, dass eine Verringerung des N-Eintrags in die Umwelt aus Gründen der Nachhaltigkeit von der Gesellschaft erwünscht wird. Dementsprechend gewinnt der Gedanke einer protein- und daher N-reduzierten Fütterung von Wiederkäuern zunehmend an Bedeutung. Aus ökonomischer und ökologischer Sicht rückt neben dem N-Gehalt in der Wiederkäuerfütterung auch der Phosphorgehalt (P) zunehmend in den Fokus. Die globale Ressourcenknappheit von P führt dazu, dass Futtermittel mit verringertem P-Gehalt immer ernsthafter in Erwägung gezogen werden. Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Umsetzung solcher Fütterungskonzepte ist es, Wachstum und Leistung der Tiere dadurch nicht zu beeinträchtigen. Dank des ruminohepatischen Kreislaufs und des Phosphat-(Pi)-Recyclings sind Wiederkäuer in der Lage, den N-Stoffwechsel sowie die Pi - Homöostase in Zeiten geringerer N- und P-Versorgung über das Futter anzupassen und somit Wachstum und Stoffwechsel aufrechtzuerhalten. Der Hauptbestandteil des im Körper vorliegenden Pi und Calcium (Ca) befindet sich im Knochen, wodurch dieser dazu beiträgt, eine ausreichende Menge dieser Mineralstoffe im Blut zu gewährleisten. Bei einer verminderten Pi-Konzentration im Blut, wie es in P-restriktiv gefütterten Ziegen bereits festgestellt wurde, wird dies aus dem Knochen mobilisiert und wirkt somit einem weiteren Absinken der Blutkonzentration von Pi entgegen. Auch in N-restriktiv gefütterte Ziegen vorangegangener Studien wurde eine Veränderung des Knochenstoffwechsels festgestellt, der Folge des Absinkens der Ca-Spiegel im Blut war. Der aus dem Knochen stammende Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23 (FGF23) gilt als Regulator der Ca- und Pi-Homöostase sowie des Vitamin D Stoffwechsels. Er reguliert die Expression der Natrium (Na)-gesteuerten Pi-Cotransporter in der Niere und beeinflusst somit die Pi-Exkretion in der Niere. Außerdem reguliert FGF23 die Expression von Cytochrom P450 Familie 27 Unterfamilie B Mitglied 1 (CYP27B1), was die aktive Form des Vitamin D, Calcitriol (1,25(OH)2D3), hydroxyliert, und folglich zu einer Anpassung der Resorption von Ca aus dem Darm führt. Ein weiterer Einflussfaktor auf die FGF23 Expression im Knochen ist die Konzentration des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors (IGF1) und von Insulin im Blut, die zu einer Hemmung der FGF23 Expression führen. Mit einer reduzierten N-Aufnahme verminderte sich die IGF1-Konzentration im Blut von Ziegen aus vorausgegangenen Studien, weshalb davon auch in diesem PhD Projekt ausgegangen wird. Als direkte Folge davon wird eine erhöhte FGF23 Expression im Knochen erwartet, die zu einer Reduzierung von Calcitriol im Blut führt. Der Grund dafür ist die FGF23-bedingte Hemmung der CYP27B1 Expression in der Niere. Bei Monogastriern führte eine P-Reduktion zu einer verminderten Freisetzung des FGF23 aus den Knochen. Daher wird in diesem PhD-Projekt der Einfluss einer P-Reduktion auf die FGF23 Freisetzung aus den Knochen wachsender Ziegen bestimmt. Außerdem wird die CYP27B1-Expression quantifiziert und die renale Synthese von Calcitriol bestimmt. Das Ziel dieses PhD Projektes ist es, die Regulationsmechanismen der Mineralstofftransporter und der Vitamin-D-Synthese in der Niere als Folge einer N- und/oder P-restriktiven Fütterung zu charakterisieren. Außerdem sollen mögliche Veränderungen der Knochenmineralisierung aufgrund der unterschiedlichen Fütterungen molekularbiologisch untersucht werden. Im ersten Teil des PhD-Projektes wurde der Effekt einer N- und/oder P-reduzierten Fütterung auf den renalen Vitamin D Stoffwechsel untersucht. Es zeigte sich, dass mit reduzierter N-Fütterung die Ca-Spiegel im Blut absanken, während eine reduzierte P-Fütterung zu einer Absenkung der Pi-Spiegel mit gleichzeitiger Erhöhung der Ca- und Magnesium (Mg2+)-Spiegel im Blut führte. Sowohl in den N-restriktiv, als auch den P-restriktiv gefütterten Tieren sank die Genexpression von CYP27B1 signifikant ab. In den N-restriktiv gefütterten Ziegen wurde zusätzliche eine reduzierte Proteinexpression von CYP27B1 festgestellt. Die verminderte CYP27B1 Expression wurde, wie erwartet, durch eine (im Trend) reduzierte IGF1 Konzentration im Blut ausgelöst. Der Anstieg der Ca- und Mg2+-Konzentrationen im Blut, die durch die P-restriktive Fütterung entstanden sind, trugen in diesen Tieren zusätzlich zu der verminderten CYP27B1 Expression in der Niere bei. Trotz der verminderten CYP27B1 Expression in den restriktiv gefütterten Ziegen dieser PhD-Studie, veränderten sich die Calcitriolwerte im Blut nicht. Auch die Blutwerte der Hormonvorstufe von Calcitriol, dem Calcidiol (25(OH)D3), blieben unverändert, wohingegen ein Abbauprodukt von Vitamin D, 24,25-dihydroxyvitamin D3 (24,25(OH)2D3), in den P-restriktiv gefütterten Tieren vermindert war. Durch die niedrigeren Pi-Spiegel im Blut reduzierte sich zusätzlich noch die FGF23 Genexpression im Knochen. Als Folge dessen wurde die Gen- und Proteinexpression des Rezeptors für FGF23 in der Niere, Fibroblasten Wachstumsfaktor Rezeptor 1 (FGFR1), gehemmt während sein Co-Rezeptor α-Klotho unverändert blieb. Da in Monogastriern eine Vitamin D – abhängige Regulierung der α-Klotho-Expression festgestellt wurde, sind die gleichbleibenden Calciriolwerte im Blut wahrscheinlich der Grund für die unveränderte α-Klotho-Genexpression in den Ziegen dieser Studie. Daraus ließ sich schließen, dass eine N- und P-restriktive Fütterung in Ziegen die Vitamin D Synthese in der Niere beeinträchtigte. Außerdem verringerte die P-Restriktion die FGF23 Expression in den Knochen, worauf eine direkte Absenkung der FGFR1 Expression in der Niere folgte. Im zweiten Teil des PhD-Projektes wurde der Effekt einer N- und/oder P-reduzierten Fütterung auf den Knochenstoffwechsel von jungen Ziegen erforscht. Dazu wurden Blutparameter des Knochenstoffwechsels, sowie die Genexpression von zahlreichen Einflussfaktoren im Knochenstoffwechsel bestimmt. Mit der N-Restriktion wurde von einer Erhöhung der Knochenumbaurate in den Ziegen ausgegangen. Dies spiegelte sich durch eine Erhöhung des Markers für Knochenresorption, β-CrossLaps (CTX), sowie einer gleichzeitigen Erhöhung des Markers für Knochenaufbau, Osteocalcin (OC), wider. Ausgelöst wurde dieser Effekt durch die verringerten Ca-Spiegel im Blut. Mit P-Restriktion stieg die Konzentration der knochenspezifischen Alkalischen Phosphatase, ein Marker für die Knochenbildung, im Blut an, wahrscheinlich um freies Pi im Blut zu generieren. Gleichzeitig wurde eine verminderte Blut- und Genexpression von OC in diesen Ziegen festgestellt. Ein Energiedefizit, wie es auch in P-restriktiven Ratten gezeigt wurde, war vermutlich der Auslöser für den Abfall der OC-Konzentration. Zudem verminderten die erhöhten Ca-Spiegel im Blut wahrscheinlich die Knochenbildung. In Monogastiern reguliert die Pi-Konzentration im Blut durch bisher unbekannte Mechanismen die FGF23 Expression im Knochen. Um herauszufinden, ob das auch für Wiederkäuer gilt, wurden neben der bereits erwähnten FGF23 Genexpression in den Ziegen zusätzlich noch Gene weiterer, die FGF23 Expression beeinflussender, Signalwege bestimmt. In den P-reduziert gefütterten Ziegen wurde gezeigt, dass die Blutkonzentration von Pi von allen Signalwegsfaktoren den größten Einfluss auf die FGF23 Expression hat. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Veränderungen in der Mineralstoffhomöostase durch sowohl eine N- als auch eine P-restriktive Fütterung die Knochenbildung beeinträchtigten. In den P-restriktiv gefütterten Ziegen war die verringerte Pi Konzentration im Blut der dominierende Einflussfaktor für die FGF23 Expression im Knochen. In weiterführenden Untersuchungen sollte die Proteinexpression aller beteiligten Signalwegsfaktoren im Knochen untersucht werden, um die Regulation der FGF23 Expression auf translationaler Ebene durch eine N- und/oder P- verminderte Fütterung feststellen zu können. Das in diesem PhD-Projekt erlangte Wissen bietet eine gute Grundlage dafür, sich in zukünftigen Studien auf die einzelnen Signalwege zu fokussieren, indem alle Einflussfaktoren auf diesen Signalweg untersuchen werden.
The global demand for food from animal products is increasing, while the amount of pasture and arable land is limited. These factors are predestined for a future shortage of nitrogen (N) and therefore crude protein (CP) in animal feed. In addition, a reduction in N input into the environment is desired by the society for reasons of sustainability. Accordingly, the idea of protein- and therefore N-reduced feeding of ruminants is becoming increasingly important. In addition to the N content in ruminant feed, the phosphorus (P) content is also coming into focus from an economic and ecological perspective. The global scarcity of P resources means that feedstuffs with a reduced P content are being considered more and more seriously. An important condition for the successful implementation of such feeding concepts is that the growth and performance of the animals are not impaired. Thanks to the rumino-hepatic cycle and phosphate (Pi) recycling, ruminants are able to adapt N metabolism and Pi homeostasis in times of reduced N and P supply via the feed and thus maintain growth and metabolism. The bone also helps to ensure a sufficient Pi concentration in the blood. The main amount of Pi and calcium (Ca) present in the body is found in the bone. If the Pi concentration in the blood is reduced, it is mobilized from the bone and thus counteracts a further drop in the blood concentration of Pi. In earlier studies, a change in bone metabolism was also observed in goats with N-restriction, which was due to a drop in blood Ca levels. Bone-derived fibroblast growth factor 23 (FGF23) is considered a regulator of Ca and Pi homeostasis and vitamin D metabolism. FGF23 regulates the expression of sodium (Na)-dependent Pi cotransporters in the kidney and thus influences the renal Pi excretion. In addition, FGF23 regulates the expression of cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 (CYP27B1), which hydroxylates the active form of vitamin D, calcitriol (1,25(OH)2D3), leading to an adjustment in the uptake of Ca from the intestine. The main factor initiating FGF23 expression in bone is the blood concentration of Pi,but there are several other factors influencing its expression. Among these, the insulin-like growth factor (IGF1) and the insulin concentration in the blood inhibit FGF23 expression. In previous studies, the IGF1 concentration in the blood of goats decreased with reduced N intake. In the following, FGF23 expression in the bones is expected to increase. As a result, a reduction in blood calcitriol concentrations is predicted. This is because FGF23 inhibits CYP27B1 expression in the kidney. In monogastric species, P-reduction led to a reduced release of FGF23 from bone. Therefore, it should be observed whether P-reduction leads to an inhibition of FGF23 release from the bones of young goats and thus increases the renal synthesis of calcitriol by stimulating CYP27B1 expression. This study aims to characterise the regulatory mechanisms of the mineral transporters and vitamin D synthesis in the kidney as a result of an N- and/or P-restricted diet. Furthermore, the changes in bone mineralisation caused by the N- and/or P-restricted diet will be investigated at the molecular biological level. In the first part of the PhD project, the effect of N- and/or P-reduced feeding on the renal vitamin D metabolism was investigated. It was shown that N-reduced feeding led to a decrease in blood Ca levels, while P-reduced feeding led to a decrease in blood Pi levels with a simultaneous increase in blood Ca and magnesium (Mg2+) concentrations. The gene expression of CYP27B1 decreased significantly in both N-restricted and P-restricted fed animals. In the N-restricted goats, a reduced protein expression of CYP27B1 was also observed. As expected, this was caused by (a trend towards) reduced IGF1 concentration in the blood. With P-restriction, the increased blood concentration of Ca and Mg2+ also led to the decrease in CYP27B1 gene expression. Despite the reduced CYP27B1 expression with N- and/or P-restricted feeding in goats, blood calcitriol levels did not change. The blood concentration of the precursor of calcitriol, calcidiol (25(OH)D3), also remained unchanged, while the degradation product of vitamin D, 24,25-dihydroxyvitamin D3 (24,25(OH)2D3), was reduced in the P-restricted animals. The diminished Pi levels in the blood also reduced FGF23 gene expression in bone. As a result, gene and protein expression of the receptor for FGF23 in the kidney, fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1), decreased while its co-receptor α-Klotho was not affected. Since α-Klotho is vitamin D dependent in monogastric species, the unchanged level of blood calcitriol is probably responsible for the unchanged gene abundance. It can be concluded that N- and P-restricted feeding in young goats impairs the vitamin D synthesis in the kidney. Furthermore P-restriction decreases FGF23 expression in bone thereby directly decreasing the FGFR1 expression in the kidney. In the second part of the PhD project, the influence of N- and/or P-reduced feeding on the bone metabolism of young goats was investigated. For this purpose, blood parameters of bone metabolism and the gene expression of numerous factors influencing bone metabolism were determined. N-restriction was hypothesised to increase the rate of bone remodelling in the goats. This was reflected by an increase in the marker for bone resorption, β-CrossLaps and a simultaneous increase in the marker for bone formation, osteocalcin (OC). This effect was caused by the reduced Ca levels in the blood. During P-restriction, the bone formation marker bone specific alkaline phosphatase increased, most likely to generate free Pi in the blood. At the same time, a decrease in bone formation marker OC was observed. An energy deficiency probably caused the decrease in OC, as demonstrated in P-restricted rats. Furthermore, the increase in blood concentration of Ca likely diminished bone formation with P-restriction. In monogastric species, the blood concentration of Pi regulates the FGF23 expression via yet unknown mechanisms. In order to find out whether this also applies to ruminants, genes of other signalling pathways that influence FGF23 expression were determined in the goats in addition to the already mentioned FGF23 gene expression. In the P-reduced fed goats, the blood concentration of Pi was shown to have the greatest influence on FGF23 expression of all signalling pathway factors. In conclusion, the changes in mineral homeostasis caused by both N- and P-restricted feeding impaired bone formation. With P-restriction, the amount of Pi is the dominating influencing factor of FGF23 expression in the bone of young goats. Further studies should investigate the protein expression of all involved signalling pathway factors in bone to determine the regulation of FGF23 expression at the translational level by N- and/or P-reduced feeding. The knowledge gained in this PhD study provides a good basis to focus on the individual signalling pathways in future studies in young goats by investigating as many factors as possible that influence this signalling pathway. The results of this PhD project show that despite the adaptability of ruminants to a reduced N- and/or P-content in the diet, mineral homeostasis and consequently vitamin D metabolism in the kidney are impaired. The interaction of altered mineral balance and vitamin D metabolism affected bone metabolism and FGF23 expression on bone and thus the FGF23/Klotho signalling pathway in young goats.
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