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Intrinsic sensory-motor circuits regulating gastric motility

Um die funktionellen Anforderungen während der Verdauung zu erfüllen, weist der Magen, als Teil des Gastrointestinaltraktes (GIT), in seinen Regionen verschiedene Bewegungsmuster der glatten Muskelschichten auf. Während der Akkommodation kommt es im proximale Magen, welcher aus dem Fundus und dem proximalen Drittel des Corpus besteht, zu einer Relaxation, um somit als Reservoir für den Nahrungsbrei zu dienen. Im distalen Magen, bestehend aus dem restlichen Corpus und dem Antrum, tragen abwechselnd starke Kontraktionen und Relaxationen zur Zerkleinerung und Durchmischung des Speisebreis, sowie zu dessen Weitertransport in das Duodenum, bei. Die jeweiligen Motilitätsmuster werden sowohl durch extrinsische als auch durch intrinsische Mechanismen gesteuert. Das enterische Nervensystem (ENS), im Magen hauptsächlich durch den Plexus myentericus (MP) repräsentiert, leistet hier einen wesentlichen Beitrag zur intrinsischen Kontrolle. Vergleichbar mit dem Darm kann das ENS des Magens autonom arbeiten. Anders als im Darm sind die intrinsischen Reflexbögen, welche die Magenmotilität steuern, jedoch nur unzureichend bekannt. Zahlreiche Studien konnten mithilfe immunhistologischer Färbungen zeigen, dass auch im MP des Magens die Projektionen der Neurone in orale und aborale Richtung verlaufen. Vergleichbar zu den neuronalen Projektionen im Darm liefert dies die strukturelle Grundlage für Reflexbögen im MP des Magens. Abgesehen von gerichteten neuronalen Projektionen, bedarf es der Wahrnehmung eines mechanischen Reizes, um die passenden motorischen Reflexe während der Nahrungsaufnahme auszulösen. Bislang wurden mechanosensitive enterische Neurone (MEN) jedoch nur im Corpus des Meerschweinchenmagens untersucht, nicht aber im Fundus und Antrum. Da die verschiedenen Magenregionen während des Verdauungsvorganges unterschiedliche Motilitätsmuster aufweisen, ist die Charakterisierung der MEN im Fundus und Antrum von entscheidender Bedeutung. Nur so ist ein umfassendes Verständnis der intrinsischen sensorisch-motorischen Reflexbögen, die der Steuerung der unterschiedlichen Magenmotilität zugrunde liegen, möglich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das Vorhandensein und die grundlegenden Eigenschaften von MEN im MP des Fundus und des Antrums im Meerschweinchenmagen zu untersuchen.

Im ersten Teil der PhD-Arbeit konnten MEN sowohl im Fundus als auch im Antrum nachgewiesen werden und im Anschluss aufgrund ihrer wichtigsten exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmitter eingeteilt werden. Zusätzlich wurden Rezeptorantagonisten eingesetzt, um Mechanorezeptoren zu identifizieren, die an der Mechanosensitivität von MEN beteiligt sind. Hierbei konnte dem transient receptor potential vanilloid channel 1 (TRPV1) eine wichtige Rolle zugesprochen werden. Da dieser Rezeptor nur an sensorischen extrinsischen Afferenzen und nicht an myenterischen Neuronen selbst vorkommt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass extrinsische Afferenzen die Mechanosensitivität von MEN durch lokale Axonreflexe beeinflussen. Die für diesen Mechanismus notwendigen Neurotransmitter und Rezeptoren sind noch nicht abschließend identifiziert und bedürfen weiterer Untersuchungen. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse des ersten Teils des Promotionsprojekts, dass das ENS in allen Teilen des Magens in der Lage ist, mechanische Reize wahrzunehmen und zu verarbeiten.

Da sich die Magenwand und somit auch die darin gelegenen myenterischen Ganglien in vivo unter ständiger Bewegung und Verformung befinden, stellte sich nun die Frage, welche Auswirkung dies auf MEN hat. Dieser Fragestellung wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Hierbei zeigte sich, dass eine verstärkte Dehnung der myenterischen Ganglien während des Versuches zu einer erhöhten Anzahl der MEN führte, die auf einen mechanischen Stimulus antworteten. Darüber hinaus verschoben sich die Verhältnisse von cholinergen und nitrergen MEN in stärker gedehnten Ganglien weiter in Richtung des nitrergen Chemotyps. Das bisherige Wissen zur intrinsischen Steuerung der adaptiven Relaxation, als Teil der Akkommodation, stimmt mit den in Manuskript II beschriebenen Ergebnissen überein. Die adaptive Relaxation wird durch das ENS vermittelt und ist daher auch im isolierten Magen vorhanden. Der beschriebene Reflex setzt erst ab einer bestimmten Dehnung der Magenwand ein, kongruent mit der hier beobachteten Zunahme der antwortenden MEN bei vermehrter Vordehnung der Ganglien. Des Weiteren ist die adaptive Relaxation unabhängig von der Ausschüttung des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin, bedarf jedoch der Freisetzung von Stickoxid als inhibitorischen Neurotransmitter. Auch dies passt zu den Ergebnissen des zweiten Teils der Arbeit, indem mit vermehrtem Stretch der Ganglien eine anteilige Zunahme der nitrergen MEN beobachtet werden konnte. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das erhöhte Antwortverhalten der MEN im Fundus mit zunehmender Dehnung der Ganglien auf eine entscheidende Rolle in der Vermittlung der adaptiven Relaxation hinweist.

Zusätzliche Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Projektionen von MEN an nachgeschaltete Neurone zu verstehen. Die Idee hierbei war, in einem Ganglion durch mechanische Stimulation Antworten von MEN hervorzurufen und zeitgleich in einem benachbarten Ganglion die durch MEN hervorgerufenen neuronalen Antworten aufzunehmen. Aus diesem Versuchsaufbau konnten jedoch keine reproduzierbaren Daten gewonnen werden, was vermutlich sowohl auf technische Schwierigkeiten als auch auf die physiologischen Eigenschaften von MEN zurückzuführen ist. Dies könnte zum Beispiel in einer Multifunktionalität der MEN, wie sie bereits im Dünndarm des Meerschweinchens bekannt ist, begründet sein. Dort fungiert etwa die Hälfte der MEN als Motoneurone, das heißt sie projizieren direkt an die glatte Muskulatur und nicht an andere Neurone innerhalb des MP. Um die Projektionsziele von MEN zu verstehen, wäre in zukünftigen Untersuchungen die Kombination aus retrograder Kennzeichnung und anschließender Identifizierung der MEN im funktionellen Neuroimaging von Interesse, um so MEN auch im Magen als Interneurone und Motoneurone charakterisieren zu können.

Neben den extrinsischen Mechanismen, die in vivo größtenteils die Kontrolle der Magenmotilität übernehmen, kann zusammenfassend gesagt werden, dass auch das intrinsische Nervensystem durch feine Modulation, sowie durch seine Fähigkeit zur Adaption eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Magenmotilität übernimmt. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass MEN in allen Regionen des Magens vorkommen und auch hier in der Lage sind, auf mechanische Stimuli mit neuronaler Aktivität zu reagieren und sich dementsprechend zu adaptieren. Diese Ergebnisse bieten eine wichtige Basis für das weitere Verständnis von intrinsischen Reflexbögen, die den Muskelbewegungen in den unterschiedlichen Magenregionen zu Grunde liegen.

The stomach as part of the gastrointestinal tract (GIT) displays various muscle motility patterns in its regions to fulfill the functional requirements during digestion. During the accommodation phase, the proximal stomach shows relaxation to serve as a reservoir for the ingesta. In the distal stomach, on the other hand, alternating strong contractions and relaxation contribute to grinding and mixing of the chyme as well as further transportation into the duodenum. The respective muscle motility patterns are controlled by both extrinsic and intrinsic mechanisms. The enteric nervous system (ENS), mainly represented by the myenteric plexus (MP) in the stomach, essentially contributes to intrinsic control here. Comparable to the intestine, the ENS of the stomach can work autonomously. However, other than in the intestine, the intrinsic reflex circuits controlling gastric motility are poorly understood. Immunohistochemical labeling revealed oral and aboral projections of the gastric myenteric neurons. Comparable to the neuronal projections in the MP of the intestine, this provides the structural basis for reflex circuits in the gastric MP. Apart from directed neuronal projections, the perceiving of a mechanical stimulus is required to trigger a respective reflex during food intake. However, to date, mechanosensitive enteric neurons (MEN) have only been investigated in the guinea pig gastric corpus, but not in the fundus and the antrum. As the different stomach regions display different muscle motility patterns, the characterization of MEN in the fundus and antrum is crucial for a comprehensive understanding of the intrinsic sensory-motor circuits underlying gastric motility. The aim of this PhD project was therefore to investigate the presence and fundamental properties of MEN in the MP of the guinea pig gastric fundus and antrum.

 

In the first part of the PhD project, MEN were detected in both the fundus and the antrum. Subsequently, immunohistochemical staining was performed, which allowed a classification of cholinergic and nitrergic MEN. Additionally, receptor antagonists were used to identify mechanoreceptors involved in the mechanosensitivity of MEN. The transient receptor potential vanilloid channel 1 (TRPV1) was attributed an important role in it. Since this receptor only occurs on sensory extrinsic afferents and not on myenteric neurons themselves, these results indicate that extrinsic afferents affect MEN’s responsiveness through local axon reflexes. The necessary neurotransmitters and receptors for this mechanism have not yet been conclusively determined and require further investigations. Overall, the results of the first part of the PhD project confirmed that the ENS in all parts of the stomach is able to perceive and process mechanical stimuli.

In vivo the stomach wall and therefore the therein located ganglia of the MP are subjected to constant mechanical forces and deformation. The arising question, to what extent ganglionic stretch affects MEN, was investigated in the second part of the PhD project. Here, it was found that an increased stretch of the myenteric ganglia also increased the number of MEN responding to mechanical stimulation. Beyond that, the ganglionic stretch led to a higher proportion of nitrergic MEN recruited by mechanical stimulation in comparison to the less stretched ganglia. These results presented in manuscript II confirm previous knowledge of the intrinsic control of adaptive relaxation as part of the accommodation reflex. The adaptive relaxation is mediated by the ENS and is therefore still present in the isolated stomach. This reflex only sets in at a certain stretch of the stomach wall, congruent with the increased number of MEN observed here with increased ganglionic stretch. Furthermore, adaptive relaxation is independent of the release of the excitatory neurotransmitter acetylcholine, but dependent on nitric oxide as inhibitory neurotransmitter. This also fits with the results of the second part of the study, in which a proportional increase in inhibitory MEN was observed with increased stretch of the ganglia. To conclude, the increasing responsiveness of MEN correlating with the increased ganglionic stretch strongly hints towards their decisive role in mediating the adaptive relaxation.

Additional investigations were conducted to understand the projection of MEN to second order neurons. The idea behind those experiments was to mechanically stimulate MEN in one ganglion and simultaneously record the transmitted neuronal responses in neighboring ganglia. However, no reproducible data could be obtained during those experiments, probably due to both technical difficulties as well as the physiological properties of MEN. In this context, the possibility of multifunctionality of MEN, as already known in the guinea pig small intestine, must be considered. In the small intestine, about half of MEN function as motoneurons, i.e., they project directly to the smooth muscles and not to other neurons within the MP. To better understand the projection targets of MEN, other techniques could be used in the future, such as retrograde labeling to distinguish interneurons from motoneurons.

In addition to the extrinsic mechanisms, which predominantly control gastric motility in vivo, the intrinsic nervous system also plays an important role in controlling gastric motility through fine modulations and its ability to adapt. The present study has shown that MEN are present in all regions of the stomach and able to respond and adapt to mechanical stimuli. These results provide an important basis for the further understanding of intrinsic reflex circuits underlying muscle movements in the different gastric regions.

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