Diagnostik von Streptococcus suis und Actinobacillus pleuropneumoniae mit der Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Streptococcus (S.) suis ist ein bedeutender Krankheitserreger beim Schwein, spielt aber auch eine Rolle als Zoonoseerreger und damit für die Lebensmittelsicherheit und die öffentliche Gesundheit. Sowohl Präventions- als auch Therapiemaßnahmen gegenüber S. suis sind von einer schnellen und zuverlässigen Erregerdiagnose abhängig, da das Krankheitsbild bei unterschiedlichen Differentialdiagnosen gleich ist. Der Wunsch nach einer schnellen und einfachen diagnostischen Methode, die möglichst vor Ort durchgeführt werden kann, führte vor einiger Zeit zur Entwicklung der Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Obwohl bereits mehrere LAMP-Methoden für den Nachweis von S. suis im Bereich der Humanmedizin und der Lebensmittelkontrolle entwickelt wurden, fehlt es bis heute an einem Serotypübergreifenden LAMP-Assay für die feldtaugliche Diagnostik an Proben von erkrankten Schweinen. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde erstmals ein LAMP-Assay entwickelt und validiert, der auf dem Aspartokinase/Homoserin-Dehydrogenase kodierenden Gen (thrA-Gen) für die Detektion von S. suis basiert. Mit 99% Inklusivität und 100% Exklusivität zeigte sich die thrA-LAMP als hochspezifisch für S. suis, so dass S.-suis-Isolate aller klinisch relevanten Serotypen detektiert werden konnten. Die relativ große Stichprobe an Isolaten mit einer breiten genetischen Vielfalt, die für die Validierung genutzt wurde, erlaubte eine sicherere Validierung der analytischen Spezifität der thrA-LAMP als bei vergleichbaren bereits publizierten S.-suis-LAMP-Assays. Mit der LPTV-Koch-Methode konnte ein einfaches, schnelles und materialarmes DNA-Extraktionsverfahren mit der thrA-LAMP kombiniert werden, welches den Einsatz der Methode außerhalb eines Labors unter Feldbedingungen ermöglicht. In direkter Gegenüberstellung von vier verschiedenen DNA-Extraktionsverfahren erzielte die thrA-LAMP kombiniert mit der LPTV-Koch-Methode die niedrigste Nachweisgrenze von 1,08 KbE/Reaktionsansatz (2,2 x 10^3 KbE/mL). Die anwendungsbezogene Nachweisgrenze dieses LAMP-Assays wurde anhand von Einmischversuchen mit physiologischer Gehirn- und Gelenksmatrix bestimmt. In Kombination mit der LPTV-Koch-Methode wurde für die thrA-LAMP eine Nachweisgrenze von 10^4 − 10^5 KbE/Tupfer für Gehirngewebe und 10^3 − 10^4 KbE/Tupfer für Gelenksgewebe ermittelt. Dabei zeigte sich die thrA-LAMP als robust gegenüber inhibitorischen Effekten der Gehirn- und Gelenksmatrix. Die Ergebnisse des direkten Vergleichs der anwendungsbezogenen Nachweisgrenze von LAMP und real-time PCR ließen darauf schließen, dass die angenommene höhere Robustheit der LAMP-Methode gegenüber Inhibitoren im Vergleich zur PCR von der untersuchten Matrix abhängig ist. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse des Einmischversuches kann die thrA-LAMP in Kombination mit der LPTV-Koch-Methode als geeignet für den Nachweis von S. suis aus Gehirn- und Gelenkstupfern von Schweinen betrachtet werden. Die Anwendung des DNeasy® Blood & Tissue Kits verbesserte lediglich die LAMP-Nachweisgrenze für Gehirntupfer. Auf Basis von klinischen Proben erkrankter Schweine wurden die diagnostischen Gütekriterien der thrA-LAMP in Kombination mit der LPTV-Koch-Methode und des DNeasy® Blood & Tissue Kits durch Gegenüberstellung mit der kulturellen Untersuchung bzw. real-time PCR als Referenzmethode bestimmt. In Kombination mit der LPTV-Koch-Methode lag die mittlere diagnostische Sensitivität für den Nachweis von S. suis aus Gehirntupfern in Bezug auf die kulturelle Untersuchung bei 88% und die Spezifität bei 96%. In Bezug auf die real-time PCR lag die Sensitivität bei 77% und die Spezifität bei 100%. Für den thrA-LAMP-Nachweis von S. suis aus Gelenktupfern nach Anwendung der LPTV-Koch-Methode war die mittlere diagnostische Sensitivität in Bezug auf die kulturelle Untersuchung bei 10% und die Spezifität bei 100%. In Bezug auf die real-time PCR war die Sensitivität bei 4% und die Spezifität bei 100%. Die thrA-LAMP in Kombination mit der LPTV-Koch-Methode eignet sich daher für den Nachweis von S. suis aus Gehirntupfern klinisch kranker Schweine, jedoch nicht für den S.-suis-Nachweis aus Abstrichen entzündlich veränderter Gelenke. In Kombination mit dem DNeasy® Blood & Tissue Kit konnte für beide Matrizes die LAMP-Sensitivität verbessert werden, sodass mit diesem Extraktionsverfahren auch eine Anwendung der LAMP für Gelenkstupfer möglich ist. Als Ursache für die unerwartet niedrige Sensitivität der thrA-LAMP für den S.-suis-Nachweis aus Gelenkstupfern klinisch kranker Tiere wurden gelenksspezifische, entzündungsassoziierte Inhibitoren vermutet (z.B. Immunglobulin G), die mit der kit-basierten DNA-Extraktion eliminiert werden konnten. Der direkte Vergleich der Materialkosten zeigte das Potenzial der LAMP-Methode als günstigere Alternative zur real-time PCR bei Verwendung einer simplen DNA-Extraktionsmethode. Zukünftig sollten thrA-LAMP und LPTV-Koch-Methode für den Einsatz an intra-vitam Proben, wie Blutproben oder Punktate der Gelenks- und Zerebrospinalflüssigkeit optimiert werden. Damit könnte die Notwendigkeit einer diagnostischen Sektion umgangen werden. Eine zusätzliche Validierung der thrA-LAMP in Bezug auf Liquor- und Synovia-Punktate des Menschen könnte die intra-vitam Diagnostik von S. suis in der Humanmedizin ergänzen. Actinobacillus pleuropneumoniae (App) kann im Falle eines klinischen Ausbruchs zu hohen Tierverlusten und wirtschaftlichen Einbußen führen. Eine wesentliche Strategie in der Prävention App-assoziierter Krankheiten besteht in der Verhinderung des Eintrags in den Bestand. Als Haupteintragsquelle gelten subklinisch-infizierte Trägertiere (,,Carrier‘‘), in denen App asymptomatisch die Tonsille besiedelt. Serologische Untersuchungen in Kombination mit App-spezifischen PCRs aus Tonsillenabstrichen gelten als das Mittel der Wahl zur Identifizierung subklinisch-infizierter Trägertiere. Mit der LAMP-Methode erhoffte man sich eine günstigere Alternative zur PCR, welche darüber hinaus direkt am Ort des Geschehens verwendet werden könnte. Im zweiten Teil der vorliegenden Studie wurden die neuartige pilQ- und eamA-LAMP entwickelt, optimiert und für den spezifischen Nachweis von App validiert. Das vielfältige Tonsillenmikrobiom des Schweines birgt eine hohe Gefahr von falsch-positiven Ergebnissen aufgrund von Kreuzreaktionen mit verwandten Nicht-Zielspezies. Aus diesem Grund wurde die analytische Spezifität beider LAMP-Assays an einer möglichst großen und vielfältigen Stichprobe an Ziel- und Nicht-Zielspezies überprüft. Während beide LAMP-Assays 100% Inklusivität erzielten, zeigte die pilQ-LAMP eine Kreuzreaktion mit der nahe verwandten Spezies Actinobacillus (A.) lignieresii. Aufgrund der Hinweise, dass A. lignieresii zum Tonsillenmikrobiom des Schweines gehört, wurde die pilQ-LAMP als ungeeignet für den spezifischen Nachweis von App aus der Tonsille angesehen. Im Gegensatz dazu konnten mit der eamA-LAMP 100% der untersuchten Nicht-Zielspezies als richtig-negativ identifiziert werden. Durch einen großen Stichprobenumfang, der auch nahverwandte Spezies der Gattung Actinobacillus umfasste, konnte die analytische Spezifität der eamA-LAMP sicher validiert werden. Damit wurde der Grundstein für eine zukünftige Validierung der eamA-LAMP an Tonsillenabstrichen gelegt.