Überprüfung der Wirksamkeit von spezifischen Bakteriophagen gegen genitalpathogene Erreger der Stute in vitro und ex vivo

Hüsch, Ronja

Dissertation 2024 CC BY-NC 4.0

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Überprüfung der Wirksamkeit von spezifischen Bakteriophagen gegen genitalpathogene Erreger der Stute in vitro und ex vivo

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Das Ziel dieser Studie war es, spezifische Bakteriophagen (Phagen) gegen genitalpathogene Erreger (Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa) der Stute zu isolieren, zu charakterisieren und in vitro sowie ex vivo zu testen.

Die Phagen wurden aus 14 Proben, die aus Stallungen und vom Pferd selbst stammten, mittels der Soft-Agar-Overlay-Technik isoliert und anschließend aufgereinigt. Die Plaquemorphologie aller isolierten Phagen zeigte eine deutliche Lysezone, die beim Phagen vB_KpnM_LmqsRe27-1 von einem doppelten Halo umgeben war. 28 Phagen konnten im Anschluss vermehrt und durch Bestimmung des Wirtsspektrums (Efficiency of Plating) charakterisiert werden, wobei die Phagen vB_SeqZP_LmqsRe26-3 (81,08%), vB_SeqZP_LmqsRe26-2 (78,38%), vB_PaeS_LmqsRe25-1 (42,42%), vB_KpnS_LmqsRe28-1 (38,46%), vB_KpnS_LmqsRe28-2 (30,77%) die größten Wirtsspektren aufwiesen.

Anhand der weiteren Charakterisierung von sieben ausgewählten Phagen mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen und Genomsequenzierung konnten alle Phagen der Klasse der Caudoviricetes zugeordnet werden, wovon drei (vB_SeqZP_LmqsRe26-1, vB_SeqZP_LmqsRe26-2, vB_SeqZP_LmqsRe26-3) zu den Podiviren, drei (vB_KpnS_LmqsRe28-1, vB_KpnS_LmqsRe28-2, vB_PaeS_LmqsRe25-1) zu den Siphovirenund einer (vB_KpnM_LmqsRe27-1)zu den Myoviren gezählt werden.

In einer Flüssigkultur (Planktonic Killing Assay) wurden diese sieben Phagen in verschiedenen Infektionsmultiplizitätsstufen (MOI 1, 10, 100, 1000) zusammen mit ihren jeweiligen Wirtsbakterien für 24 h inkubiert und das Bakterienwachstum wurde stündlich mittels optischer Dichtemessung (OD₆₀₀) gemessen. Die Versuche mit den Phagen vB_SeqZP_LmqsRe26-2 und vB_SeqZP_LmqsRe26-3 zeigten eine signifikante Reduktion der Bakteriendichte bei einem MOI von 1. Die drei K. pneumoniae-spezifischen Phagen konnten sogar mit beiden MOIs (1 und 10) das Bakterienwachstum der jeweiligen Wirtsbakterien signifikant reduzieren.

Mit Hilfe eines Biofilm-Modells wurde die Wirksamkeit der Phagen vB_KpnS_LmqsRe28-1, vB_KpnM_LmqsRe27-1 und vB_PaeS_LmqsRe25-1 gegen 48 h alte präformierte Biofilme ex vivo getestet. In einer Mikrotiterplatte wurden Bakteriensuspensionen der jeweiligen Wirtsbakterien für 48 h bei 37°C inkubiert und anschließend die Phagensuspensionen (MOI 1 und 10) zugegeben. Nach 6 und 24 h wurde die Bakterienkonzentration im Biofilm mittels Ausplattierungsverfahren ermittelt und die Biofilmmasse durch Kristallviolettfärbung und Messung der optischen Dichte (OD₆₀₀) bestimmt. Die applizierten Phagen konnten weder die Bakterienkonzentration noch die Biofilmmasse signifikant reduzieren, was auf multiple Abwehrmechanismen der Wirtsbakterien innerhalb einer Biofilmmatrix und das Fehlen von Depolymerase-Genen der Phagen zurückzuführen sein könnte.

Die lytische Aktivität der Phagen vB_SeqZP_LmqsRe26-2 und vB_SeqZP_LmqsRe26-3 wurde in einem Explant-Modell des equinen Uterus ex vivo getestet. Dafür wurden Explants aus dem Endometrium von Schlachtgebärmüttern entnommen und für 24 h in einem Kulturmedium unter Zugabe des jeweiligen Wirtsbakteriums inkubiert. Eine Stunde nach Versuchsbeginn wurden die Phagensuspensionen (MOI 1 und 10) appliziert und nach Versuchsende das Bakterienwachstum sowie die Phagenkonzentration auf den Explants bestimmt. Eine signifikante Reduktion der Bakterienkonzentration konnte nicht erreicht werden, jedoch waren die Phagen nach 24 h Inkubation auf den Explants nachweisbar. In den in dieser Studie erstmals publizierten heliumionenmikroskopischen Aufnahmen des equinen Endometriums konnten präsumtive Bakterien-Phagen-Interaktionen auf der Uterusschleimhaut dargestellt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Phagen gegen genitalpathogene Erreger der Stute erfolgreich isoliert und weiter charakterisiert werden konnten. Die Anwendung der Phagen in in vitro- sowie ex vivo-Versuchen zeigt vielversprechende Ergebnisse für den therapeutischen Einsatz der Phagen gegen equine Genitalpathogene in weiterführenden ex vivo- sowie in vivo- Studien.

The objective of this study was to isolate and characterise bacteriophages (phages) specific to genital pathogens (Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) in mares and to evaluate their efficacy in vitro and ex vivo.

Phages were isolated from samples (n = 14) from horse husbandries and horses. Phages were isolated and purified using the soft-agar overlay technique. The plaque morphology of all isolated phages showed a clear lysis zone, which was surrounded by a double halo in the case of phage vB_KpnM_LmqsRe27-1. 28 phages were subsequently propagated and characterised by determining the host spectrum (efficiency of plating), with phages vB_SeqZP_LmqsRe26-3 (81, 08%), vB_SeqZP_LmqsRe26-2 (78.38%), vB_PaeS_LmqsRe25-1 (42.42%), vB_KpnS_LmqsRe28-1 (38.46%), vB_KpnS_LmqsRe28-2 (30.77%) exhibited the largest host spectra.

Based on the further characterisation of seven selected phages using electron microscopic images and genome sequencing, all phages were assigned to the class Caudoviricetes. Of these, three (vB_SeqZP_LmqsRe26-1, vB_SeqZP_LmqsRe26-2, vB_SeqZP_LmqsRe26-3) can be described as Podoviruses, three (vB_KpnS_LmqsRe28-1, vB_KpnS_LmqsRe28-2, vB_PaeS_LmqsRe25-1) as Siphoviruses, and one (vB_KpnM_LmqsRe27-1) as a Myovirus.

In a liquid culture (planktonic killing assay), the seven phages were incubated with their respective host bacteria for 24 hours at different multiplicity of infection levels (MOI 1, 10, 100, 1000). Bacterial growth was measured hourly by optical density (OD₆₀₀) measurement. At MOI 1, the phages vB_SeqZP_LmqsRe26-2 and vB_SeqZP_LmqsRe26-3 caused a significant reduction in bacterial density. Klebsiella pneumoniae-specific phages (n = 3) were even able to significantly reduce bacterial growth in their respective host bacteria at both MOIs (1 and 10).

The efficacy of phages vB_KpnS_LmqsRe28-1, vB_KpnM_LmqsRe27-1 and vB_PaeS_LmqsRe25-1 against 48-hour-old preformed biofilms was tested using an ex vivo biofilm model. Bacterial suspensions of the respective host bacteria were incubated in a microtitre plate for 48 hours at 37°C. Phage suspensions (MOI 1 and 10) were then added. The bacterial concentration in the biofilm was determined using the plating method after 6 and 24 hours. Additionally, the biofilm mass was measured by crystal violet staining and optical density measurement (OD₆₀₀). The applied phages were unable to significantly reduce either the bacterial concentration or the biofilm mass. This lack of reduction could be attributed to multiple defence mechanisms of the host bacteria within a biofilm matrix and the absence of depolymerase-genes of the phages.

The lytic activity of phages vB_SeqZP_LmqsRe26-2 and vB_SeqZP_LmqsRe26-3 against Streptococcus equi subsp. zooepidemicus was tested in an ex vivo explant model of the equine uterus. Explants were taken from the endometrium of slaughtered uteri and incubated for 24 hours in a culture medium with the respective host bacterium added. One hour after the start of the experiment, phage suspensions with MOI 1 and 10 were applied. The bacterial growth and phage concentration on the explants were determined at the end of the experiment. Although a significant reduction in bacterial concentration was not achieved, the phages were detectable on the explants after 24 hours of incubation. In the helium-ion-microscopic images of the equine endometrium - published for the first time in this study-, presumptive bacterial-phage interactions on the uterine mucosa could be visualised.

In summary, phages against genital pathogens of the mare have been successfully isolated and characterised. Promising results were observed in in vitro and ex vivo experiments, indicating potential for therapeutic use of phages against equine genital pathogens in further ex vivo and in vivo studies.