Investigation on the role of the Transforming Growth Factor-beta pathway in a Parkinson’s disease cell model
Die Parkinson-Krankheit (PK) ist gegenwärtig die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Histopathologisch ist die Erkrankung durch Lewy Körperchen (LK) in den Neuronen der Patienten charakterisiert. LK sind proteinhaltige Einschlüsse, die hauptsächlich aus abnormal aggregiertem Alpha-Synuclein (aSyn) bestehen. Als neurotoxisch werden hierbei vorwiegend unlösliche Oligomere als Zwischenstufe zwischen Monomeren und großen aSyn Aggregaten eingeschätzt. Die Toxizität dieser aSyn-Formen wirkt sich vor Allem auf dopaminerge Neurone in der Substantia nigra aus, was zu den typischen motorischen Symptomen der PK führt. In unserer Arbeitsgruppe wurde ein Parkinson-Zellmodel etabliert, in welchem humanes Wildtyp-aSyn in dopaminergen Neuronen überexprimiert wird. Mit Hilfe dieses Modells wurde ein genomweites siRNA-Screening durchgeführt. Ergebnisse aus diesem Screening ergaben, dass die Herunterregulation von zwölf Genen, die dopaminergen Neuronen vor aSyn-induzierter Toxizität schützen kann. Von diesen zwölf Genen sind drei (Activin Rezeptor-ähnliche kinase 7, ALK7; Dynein light chain roadblock-type 1, DYNLRB1; und Glycogen synthase kinase-3 beta, GSK3B) am Transforming Growth Factor-beta (TGFb)-Signalweg beteiligt. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Herunterregulationdes TGFb-Signalwegs, die dopaminergen Neuronen vor aSyn-induzierter Toxizität schützt. Innerhalb des vorliegenden Projektes waren wir daran interessiert, die zellulären Mechanismen zu verstehen, die für den beobachteten, schützenden Effekt verantwortlich sind. Zunächst konnte durch den Einsatz von zwei verschiedenen Arten von siRNAs bestätigt werden, dass die Herunterregulationder identifizierten Gene die Zellen tatsächlich vor aSyn-induzierter Toxizität schützt. Im Anschluss haben wir untersucht, ob die Rezeptoren und die Mothers against decapentaplegic homolog (SMAD)-Proteine des TGFb-Signalwegs direkt vor aSyn-induzierter Toxizität schützen. Im Detail hat sich gezeigt, dass die Herunterregulationdes Typ-I TGFb Rezeptors ALK5 (Activin Rezeptor-ähnliche Kinase 5) sowie des SMAD2 einen schützenden Effekt in den dopaminergen Neuronen aufweist. Im Gegensatz führte eine Behandlung von aSyn-überexprimierenden Zellen mit TGFb Liganden zu einer erhöhten Zelltoxizität. Dieser Anstieg der Toxizität konnte durch eine gleichzeitige Herunterregulation von ALK5, SMAD2 und DYNLRB1 abgemildert werden. Zu guter Letzt haben wir eine Hochregulierung der Gene TGFB1, TGFB2, SMAD2, und SMAD3 in aSyn-überexprimierenden Zellen festgestellt. Zusammenfassend konnten wir aufzeigen, dass eine erhöhte Aktivität des TGFb-Signalwegs schädliche Auswirkung auf aSyn-überexprimierende Zellen hat und dass eine Herunterregulierung des TGfb-Signalwegs dopaminerge Neuronen vor aSyn-induzierter Toxizität schützt. Zusätzlich haben wir festgestellt, dass Gene des TGFb-Signalwegs in aSyn-überexprimierenden Zellen hochreguliert sind. Diese Ergebnisse liefern hilfreiche Erkenntnisse für die Entwicklung von krankheitsmodifizierenden Medikamenten gegen die Parkinson-Krankheit.
Parkinson’s disease (PD) is currently the second-most prevalent neurodegenerative disease. It is histopathologically characterized by the identification of Lewy bodies (LBs) in the neurons of PD patients. LBs are proteinaceous inclusions that are mainly composed of abnormally aggregated alpha-Synuclein (aSyn). In addition, insoluble aSyn oligomers with a size between monomer and large aggregates are believed to be neurotoxic. Such toxicity is detrimental to dopaminergic neurons in the substantia nigra, thereby leading to the observable motor symptoms. Previously, our group established a cell culture model of PD, in which we overexpress wild-type human aSyn in dopaminergic neurons. Using this model, a genome-wide siRNA screening was previously performed, and the knockdown of twelve genes were identified to be able to protect dopaminergic neurons against aSyn-induced toxicity. Within these twelve gene targets, three (Activin receptor-like kinase 7, ALK7; Dynein light chain roadblock-type 1, DYNLRB1; and Glycogen synthase kinase-3 beta, GSK3B) are involved in the Transforming growth factor-beta (TGFb) pathway. Therefore, we hypothesized that the knockdown of the TGFb pathway could protect dopaminergic neurons from aSyn-induced toxicity. In this project, we were interested to understand the cellular mechanisms behind the protectiveness resulted from the knockdown of genes related to the TGFb pathway. Firstly, by using two different types of siRNAs, we validated that the transfection with siRNA against the identified genes indeed protected cells from aSyn-induced toxicity. We then verified if the receptors and the Mothers against decapentaplegic homolog (SMAD) proteins of the TGFb pathway were directly involved in the protection against aSyn-induced toxicity. In particular, the knockdown of Activin receptor-like kinase 5 (ALK5), the type-I receptor of the TGFb pathway, as well as the knockdown of SMAD2, protected dopaminergic neurons from aSyn-induced toxicity. Furthermore, the treatment with TGFb ligands in aSyn-overexpressing cells led to a further increase in cytotoxicity. The increase in toxicity resulted from the TGFb ligand treatment in aSyn-overexpressing cells could be mitigated by a concomitant knockdown of ALK5, SMAD2, or DYNLRB1. Finally, we found an up-regulation of TGFB1, TGFB2, SMAD2, and SMAD3 in aSyn-overexpressing cells. Taken together, we reported that an increase in TGFb signaling produced detrimental effects in aSyn-overexpressing cells, and that the reduction in TGFb signaling protected dopaminergic neurons from aSyn-induced toxicity. Moreover, we identified an up-regulation of genes of the TGFb pathway specifically in aSyn-overexpressing cells. These data can provide insights in the development of disease-modifying therapies against PD.
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