Selective cultivation of Enterococcus cecorum and detection of potential transmission sources in broiler houses

Tessin, Jesper

Dissertation 2024 CC BY 4.0

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Selective cultivation of Enterococcus cecorum and detection of potential transmission sources in broiler houses

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Enterococcus cecorum (E. cecorum) gehört zu einem der wichtigsten Erreger der Geflügelindustrie. Gekennzeichnet ist die Erkrankung durch steigende Mortalitätsraten, erhöhte Schlachthofverwürfe und lahmende Tiere mit charakteristischer Paralyse zwischen der 5. und 10. Lebenswoche. Obgleich große Fortschritte in der Forschung in den vergangenen Jahren über den Erreger erzielt wurden, bestehen noch Wissenslücken über potentielle Übertragungswege und -quellen. In dieser Thesis wurden zwei Forschungsvorhaben realisiert. Zum einen wurde ein nachweislich positiver E. cecorum Bestand beprobt. Anschließend wurden Kultivierungsversuche mittels Direktausstrich auf einem Selektivmedium mit X-Gluc unternommen. In einem weiteren Versuch wurden zwei unauffällige Betriebe an verschiedenen Orten, mithilfe eines festgelegten Beprobungsschemas beprobt. Das Ziel war es, potentielle Infektionsquellen zu identifizieren und den Einfluss der Reinigung und Desinfektion auf die Nachweisrate positiver Proben zu ermitteln.

Kultivierungsversuche von E. cecorum waren in der Vergangenheit herausfordernd, da E. cecorum häufig von anderen Keimen überwuchert wurde. Es wurde gezeigt, dass E. cecorum eine ß-Glucuronidase Aktivität aufweist. Diese wurde durch ein Selektivmedium, dem das Substrat X-Gluc und Antibiotika zugefügt wurden, detektiert. Positive Kolonien erschienen blau-grün auf dem Selektivmedium. Zum Vergleich zeigten weder Escherichia coli, Enterococcus faecium noch Enterococcus faecalis ß-glucuronidase Aktivität. Von 15 verdächtigen isolierten Kolonien, wurden drei Reinkulturen mit blau-grünen Kolonien gewonnen. Zwei dieser Reinkulturen stammten aus den Proben der Kadavereimer, wohingegen die dritte Reinkultur aus der Sammelkotprobe gewonnen wurde. Eine Identifizierung des Erregers wurde mittels Katalase-Test, MALDI-TOF, qPCR und Resistenztest durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die ß-Glucuronidase Aktivität als Differenzierungswerkzeug geeignet sein könnte. Die veröffentlichte Methode sollte in zukünftigen Forschungsarbeiten evaluiert und verbessert werden, zum Beispiel durch die Zugabe anderer Antibiotika. Diese Ergebnisse sind von großer Wichtigkeit, um Wissenslücken über Übertragungswege oder -quellen zu füllen. Im Vergleich zur qPCR Detektion, können durch die Kultivierung und die Identifizierung von bakteriellen Erregern, Rückschlüsse auf die Infektiosität, Persistenz und phänotypische Resistenzen gezogen werden. Weiterhin ermöglicht die Kultivierung den Erhalt ausreichender DNA Mengen, zum Whole Genome Sequencing oder für Typisierungsmethoden. Soweit uns bekannt ist, war dies der erste Bericht, der zeigt, dass der Direktausstrich von Suspensionen aus Umweltproben auf einem chromogenen Medium die Isolierung von E. cecorum ermöglicht.

Zur weiteren Ermittlung potentieller Übertragungsquellen wurde ein standardisiertes Beprobungsschema verschiedener Bereiche auf zwei Betrieben durchgeführt. Proben wurden an neun Beprobungstagen von 25 verschiedenen Bereichen entnommen. Insgesamt wurden 1017 Proben über sechs Durchgänge (drei Durchgänge pro Betrieb) analysiert. Die Farmen zeigten keine signifikanten Unterschiede, was die Anzahl der positiven Proben betrifft. Allerdings wurden signifikante Unterschiede zwischen den Durchgängen festgestellt. So wurden im zweiten und im dritten Durchgang wesentlich weniger positive Proben detektiert. Dies könnte auf die Intensivierung der Reinigung und Desinfektion auf beiden Betrieben nach dem ersten Durchgang zurückzuführen sein. Es wurden einige positive Proben an Tag 1 (9/118) und Tag 5 (2/114) im Stall detektiert, wohingegen an Tag 10 kein positives Ergebnis mehr gefunden wurde. Die positiven Ergebnisse könnten auf eine Verschleppung des Erregers aus vorangegangenen Durchgängen hindeuten. Eine positive Sammelkotprobe an Tag 1 könnte das Ergebnis einer frühen Kolonisierung sein. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass dies bereits in der Brüterei oder dem Transport aufgetreten ist. Die meisten positiven Proben wurden an Tag 34 (23/114) und 41 (20/95) beobachtet. Da die qPCR nicht zwischen kommensalen und pathogenen Erregern unterscheidet, muss eine Bestimmung anhand der Kolonisierung im Laufe des Durchgangs vorgenommen werden. Eine typische Kolonisierung von kommensalen E. cecorum findet ab der 3. Lebenswoche statt. Da keine klinischen Zeichen zu erkennen waren, wird davon ausgegangen, dass es sich bei den positiven Proben um kommensale Stämme handelt. Es wurde gezeigt, dass Abluftöffnungen (6/53), Stiefelprofile (12/100), Kadavereimer (7/47) und Sammelkotproben (16/94) häufiger positiv waren als andere Bereiche. Diese Beprobungsorte könnten sich für das Monitoring eignen und sollten gezielt gereinigt und desinfiziert werden.

Interessanterweise kam es nach der Reinigung und Desinfektion (R&D) zu einer Reduktion der E. cecorum Nachweisrate. Wir bewiesen, dass R&D die wichtigste Maßnahme zur Prävention von E. cecorum ist. Trotzdem blieben einige Proben nach der R&D positiv, was die Möglichkeit der Wiedereinschleppung pathogener E. cecorum in nachfolgende Durchgänge denkbar macht.

Enterococcus cecorum (E. cecorum) is one of the most important pathogens in the poultry industry. The disease is characterised by rising mortality rates, increased slaughterhouse discards and lame animals with characteristic paralysis between the 5th and 10th week of life. Although great progress has been made in research into the pathogen in recent years, there are still knowledge gaps concerning potential transmission routes and sources. Two research projects were realised in this thesis. Firstly, a proven E. cecorum positive flock was sampled. Cultivation trials were carried out using a direct streaking on X-Gluc with selective media. In a further trial, two inconspicuous farms at different locations were sampled using a defined sampling scheme. The aim was to identify potential sources of infection and to determine the influence of cleaning and disinfection on the detection rate of positive samples.

Cultivation experiments of E. cecorum have been challenging in the past, as E. cecorum was often overgrown by other bacteria. It was shown that E. cecorum exhibits ß-glucuronidase activity. This could be detected using a selective medium to which the substrate X-Gluc was added. Positive colonies appeared blue-green on the selective medium. For comparison, neither Escherichia coli, nor Enterococcus faecium nor Enterococcus faecalis showed ß-glucuronidase activity. Out of 15 suspected isolated colonies, three pure cultures with blue-green colonies were obtained. Two of these pure cultures originated from the carcass buckets, whereas the third pure culture was obtained from the pooled faecal sample. The pathogen was identified using a catalase test, MALDI-TOF, qPCR and susceptibility testing. It was shown that the ß-glucuronidase activity could be suitable as a differentiation tool. The published method should be evaluated and improved in future research, for example, by adding other antibiotics. These results are of great importance in order to fill knowledge gaps about transmission routes and sources. Compared to qPCR detection, the cultivation and identification of bacterial pathogens is essential to obtain information about infectivity, persistence and phenotypic resistance. Furthermore, cultivation provides sufficient DNA for whole genome sequencing and typing methods. To the best of our knowledge, this was the first report demonstrating that direct streaking of suspensions from environmental samples on a chromogenic medium enables the isolation of E. cecorum.

To further identify potential transmission sources, a standardised sampling scheme of various locations was carried out on two farms. Samples were taken on nine sampling days from 25 different locations. A total of 1017 samples were analysed over six cycles (three cycles per farm). The farms showed no significant differences in terms of the number of positive samples. However, significant differences were found between the cycles. As a result, significantly fewer positive samples were detected in the second and the third cycle. This could be due to the intensification of cleaning and disinfection on both farms after the first round. Some positive samples were detected at day 1 (9/118) and day 5 (2/114) in the barn, whereas no more positive results were found at day 10. The positive results could indicate a spread of the pathogen from previous cycles. The positive faecal sample at day 1 might be a results of an early colonisation. It cannot be excluded that this occurred in the hatchery or during transport. Most of the positive samples were observed at days 34 (23/114) and 41 (20/95). As qPCR does not differentiate between commensal and pathogenic strains, this must be made on the basis of colonisation during the course of the production period. Typical colonisation of commensal E. cecorum occurs at the third week of life. As no clinical signs were observed, it is assumed that the positive samples can be identified as commensal strains. It was shown that air exhausts (6/53), boot profiles (12/100), carcass buckets (7/47) and pooled faecal samples (16/94) were more frequently positive than other locations. These locations could be suitable for monitoring and should be focused on during cleaning and disinfection (C&D).

Interestingly, there was a reduction in the E. cecorum detection rate after C&D. We proved that C&D is the most important measure for the prevention of E. cecorum. Nevertheless, some samples remained positive after C&D, which makes the possibility of re-entrainment of pathogenic E. cecorum in subsequent production periods conceivable.