Unraveling the role of CLRs in bacterial infections: CLEC12A as a new target in Legionella pneumophila infection

Diersing, Christina

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Unraveling the role of CLRs in bacterial infections : CLEC12A as a new target in Legionella pneumophila infection

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C-Typ-Lektinrezeptoren (CLRs) sind Teil des angeborenen Immunsystems und gehören zur Gruppe der Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors; PRRs). Sie erkennen Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns; PAMPs), die auf der Oberfläche verschiedener Krankheitserreger wie Viren, Pilze, Parasiten und Bakterien exprimiert werden. CLRs erkennen vor allem Kohlenhydratstrukturen, aber auch (Glyko-)Lipide, kristalline Strukturen und Proteine und tragen so zur Immunhomöostase und -modulation bei. Da sie hauptsächlich von Antigen-präsentierenden Zellen (antigen-presenting cells; APCs) exprimiert werden, sind sie vielversprechende Kandidaten für das Zell-Targeting, was für die Entwicklung neuer Therapeutika und kohlenhydratbasierter Impfstoffe von besonderem Interesse ist. Legionella pneumophila ist ein gramnegatives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, das über Aerosole übertragen wird. Infektionen können zur Legionärskrankheit oder zum Pontiac-Fieber führen, die besonders für ältere und immunsuppressive Patienten eine Bedrohung darstellen. Während die Immunantwort in Bezug auf Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und NOD-like-Rezeptoren (NLRs) gut charakterisiert ist, ist die Rolle der CLRs nur unzureichend bekannt. Aus diesem Grund zielte der erste Teil dieser Arbeit darauf ab, die Rolle von CLRs bei L. pneumophila-Infektionen zu verstehen. Es wurden ELISA- und durchflusszytometrische Bindungsstudien mit einer umfangreichen murinen CLR-hFc-Fusionsproteinbibliothek durchgeführt und CLEC12A als Bindungsrezeptor identifiziert. In weiteren Experimenten wurde der entsprechende Ligand untersucht und die Rolle von CLEC12A in der L. pneumophila-Infektion genauer analysiert. Die Versuche zur Identifizierung des spezifischen Liganden von CLEC12A umfassten die Isolierung von L. pneumophila LPS und die Behandlung von Bakterienlysaten mit Proteinase K. Die Ergebnisse schlossen LPS oder (Glyko-)Proteine als mögliche Ligandenkandidaten aus. Weitere Charakterisierungsversuche beinhalteten die Infektion von humanen und murinen WT- und CLEC12A^-/--Makrophagen, die eine eher begrenzte Rolle von CLEC12A bei L. pneumophila-Infektionen zeigten. Auch die In-vivo-Studien zeigten keine Unterschiede in der Bakterienbelastung oder der Zytokinsekretion zwischen WT- und CLEC12A^-/--Mäusen. Obwohl CLRs in allen Säugetierarten vorkommen, werden sie hauptsächlich bei Menschen und Mäusen untersucht. Daher konzentrierte sich das zweite Ziel auf die Übertragung der etablierten Methoden auf das bovine System, um einen tieferen Einblick in die Rolle der CLRs bei Rindern zu erhalten. Durch die Etablierung einer bovinen CLR-hFc-Fusionsproteinbibliothek war es möglich, die Wechselwirkungen zwischen bovinen CLRs und Bakterien zu untersuchen. Die Funktionalität der hergestellten bovinen CLR-hFc-Fusionsproteine wurde durch ELISA- und durchflusszytometrische Bindungsstudien mit Liganden von murinen und humanen CLR-Orthologen bestätigt. Während einige bovine CLRs (Dectin-1, DC-SIGN) eine Bindung an die Liganden ihrer maus- und humanen Orthologe zeigten, scheinen andere bovine CLRs (MICL) unterschiedliche Bindungspräferenzen zu haben. Schließlich wurde ein ELISA-basiertes Pathogen-Screening mit S. enterica durchgeführt, das erste Wechselwirkungen zwischen bovinen CLRs und Bakterien ergab. Zur Verifizierung der aktuellen Ergebnisse müssen noch durchflusszytometrische Bindungsstudien durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass diese Arbeit neue Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen CLRs und Bakterien liefert. Zunächst wurde CLEC12A als der angeborene Sensor für L. pneumophila identifiziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die auf CLR-hFc-Fusionsproteinen basierenden Methoden auf das bovine System übertragen werden können, was die Erweiterung unseres Wissens über die Rolle der CLRs im Rind ermöglicht.

C-type lectin receptors (CLRs) are part of the innate immune system and belong to the group of pattern recognition receptors (PRRs). They recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which are expressed on the surface of various pathogens like viruses, fungi, parasites and bacteria. CLRs recognize mostly carbohydrate structures, but also (glyco-)lipids, crystalline structures and proteins and thus contribute to immune homeostasis and modulation. As they are mainly expressed by antigen-presenting cells (APCs), they are promising candidates for cell targeting, which is of particular interest for the development of new therapeutics and carbohydrate-based vaccines. Legionella pneumophila is a gram-negative, facultative intracellular bacterium that is transmitted via aerosols. Infections can lead to Legionnaires’ disease or Pontiac fever, which are especially threatening to elderly and immunosuppressive patients. Since the immune response is well characterized regarding Toll-like receptors (TLRs) and NOD-like receptors (NLRs), the role of CLRs is poorly understood. For that reason, the first part of this thesis aimed to understand the role of CLRs in L. pneumophila infections. ELISA- and flow cytometry-based binding studies with a comprehensive murine CLR-hFc fusion protein library were conducted and revealed CLEC12A as the binding receptor. Further experiments included the identification of the respective ligand and a more in-depth analysis of CLEC12A’s role in L. pneumophila infections. Attempts to identify the specific ligand of CLEC12A included the isolation of L. pneumophila LPS and proteinase K treatment of bacterial lysates. The results excluded LPS or (glyco‑)proteins as potential ligand candidates. Further characterization attempts involved the infection of human and murine WT and CLEC12A^-/- macrophages, which demonstrated a rather limited role of CLEC12A in L. pneumophila infections. Similarly, the in vivo studies showed no differences in bacterial burdens or cytokine secretion between WT and CLEC12A^-/- mice. Although CLRs can be found in all mammalian species, they are mainly studied in humans and mice. Hence, the second aim focused on the transfer of the established tools to the bovine system to get a deeper insight into the role of CLRs in cattle. By generating a bovine CLR-hFc fusion protein library, it was possible to study bovine CLR/bacteria interactions. The functionality of the produced bovine CLR-hFc fusion proteins was confirmed by conducting ELISA- and flow cytometry-based binding studies with ligands of murine and human CLR orthologues. As some bovine CLRs (Dectin-1, DC-SIGN) showed binding to the ligands of their mouse and human orthologue’s, other bovine and murine CLRs (e.g. MICL) seem to have different binding preferences. Finally, ELISA-based pathogen screening was conducted with S. enterica and revealed initial bovine CLR/bacteria interactions. Still, flow-cytometry-based binding studies must be performed to verify the current results. In conclusion, this thesis provides novel insights into CLR/bacteria interactions. First, CLEC12A was identified as the innate sensor for L. pneumophila. Further, it was demonstrated that the CLR-hFc fusion protein-based methods can be transferred to the bovine system, which enables the expansion of our knowledge regarding the role of CLRs in cattle.