Blood-brain barrier functions and their impact on pharmacotherapy and pathogenesis of CNS disorders : novel in vitro and translational in vivo studies in animal models

Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) stellen weltweit eine erhebliche Krankheitslast dar, welche mit einer hohen Sterblichkeitrate und starken körperlichen Einschränkungen von Betroffenen einhergeht. Darüber hinaus steigt die Inzidenz dieser Erkrankungen weltweit an, während sich die derzeitig verfügbaren Therapiemöglichkeiten für ZNS-Erkrankungen überwiegend auf symptomatische Behandlungen beschränken. Dies verdeutlicht die Dringlichkeit der Entwicklung effektiver Behandlungsmöglichkeiten und rationaler Therapien von ZNS-Erkrankungen. Die meisten ZNS-Erkrankungen beruhen auf komplexen, vielschichtigen und bisher unvollständig verstandenen Pathomechanismen, die auf einem Zusammenwirken verschiedener zellulärer und molekularer Prozesse basieren. Ein umfassendes Verständnis der zugrunde liegenden Pathomechanismen von ZNS-Erkrankungen würde die Entwicklung effektiver Therapien vereinfachen. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS), spielt eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der ZNS-Homöostase, indem sie den Transport von Molekülen zwischen der Blutzirkulation und dem Gehirn reguliert. Gleichzeitig stellt die BHS aber auch ein Hauptproblem bei der Pharmakotherapie von ZNS-Erkrankungen dar, da im ZNS wirkende Medikamente nur erschwert über die BHS in das Gehirn gelangen können. Insbesondere Efflux-Transporter, wie P-Glykoprotein (Pgp), die von den Endothelzellen der Gehirnkapillaren exprimiert werden und das Neuropil vor aus dem Blut stammenden toxischen Substanzen schützen, schränken gleichzeitig den Transport von vielen strukturell unterschiedlichen Wirkstoffen in das Gehirn ein. Somit kann die protektive Funktion von Efflux-Transportern an der BHS zu der Entwicklung einer sogenannten Arzneimittel- oder Multidrug-Resistenz (MDR) beitragen. Darüber hinaus werden Veränderungen der BHS zunehmend mit ZNS-Erkrankungen, wie der Parkinson-Krankheit, in Verbindung gebracht und können während der Entstehung und/oder des Fortschreitens der Erkrankung auftreten. Dadurch können neurodegenerative Signalwege ausgelöst oder verstärkt werden. Insgesamt unterstreichen die beschriebenen Herausforderungen bei der Therapieentwicklung für ZNS-Erkrankungen die Relevanz prädiktiver BHS-Modelle und ZNS-Krankheitsmodelle für (i) das Hochdurchsatz-Screening von ZNS-Wirkstoffkandidaten und die Arzneimittelentwicklung, (ii) die Untersuchung von BHS-assoziierten molekularen und zellulären Mechanismen der pharmakologischen Resistenz, (iii) um Pathomechanismen aufzuklären und neue Angriffspunkte zur Therapie zu entwickeln und (iv) um neue Behandlungsstrategien zu testen. Bei entsprechenden Modellen kann es sich um In-silico-, In-vitro- oder In-vivo-Modelle handeln. Alle zuvor beschriebenen Aspekte werden in den in dieser vorliegenden Arbeit zusammengefassten Publikationen addressiert. Die in Publikationen 1 und 2 beschriebenen Studien hatten zum Ziel, In-vitro-Modelle auf der Basis von immortalisierten humanen und Ratten- Gehirnkapillarendothelzellen für das Hochdurchsatz-Screening von potenziellen ZNS-Wirkstoffkandidaten und zur Untersuchung von Pgp-vermittelter Arzneimittelresistenz zu entwickeln und für diese Zwecke zu validieren. Während die Zell-basierten In-vitro-Modelle kostengünstige, hoch flexible Systeme mit leicht kontrollierbaren Bedingungen und der Möglichkeit für Hochdurchsatz-Untersuchungen (z.B. für das Wirkstoff-Screening und die Arzneimittelentwicklung) und für detaillierte mechanistische Analysen darstellen, kann ein wesentlicher Nachteil dieser Modelle eine erhöhte Barrierepermeabilität sein. Eine erhöhe Permeabilität der immortalisierten Zellen kann durch eine Herunterregulation von Tight Junction (TJ) Proteinen bedingt sein. Daher sollten in Publikation 1 die Barriereeigenschaften der häufig genutzten humanen Gehirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 durch Transduktion mit dem TJ Protein Claudin-5 verbessert werden. Die Publikation beschreibt somit einen Ansatz zur Validierung von BHS-Modellen für das Wirkstoff-Screening. Die Transduktion mit Claudin-5 führte zu verbesserten Barriereeigenschaften der Zellen, wodurch die Rolle von Claudin-5 für die Barriereeigenschaften der BHS unterstrichen wurde. Jedoch waren die Barriereeigenschaften der Claudin-5-transduzierten hCMEC/D3-Zellen im Vergleich mit frisch isolierten primären porzinen Gehirnkapillarendothelzellen schlechter und ein vektorieller Transport eines Pgp-Substrats über die Endothelzellschicht konnte nur in den Primärzellen gemessen werden. Für eine detaillierte Untersuchung zellulärer Mechanismen der MDR an der BHS wurden hCMEC/D3-Zellen mit „enhanced green fluorescent protein“ (-EGFP) fusioniertem MDR1 (Protein: Pgp) transduziert. Wie in den Publikationen 2 und 3 beschrieben führte die Transduktion der hCMEC/D3-Zellen mit MDR1-EGFP zu mit primären Gehirnendothelzellen vergleichbaren Pgp-Expressionsleveln und ermöglichte die Untersuchung von Pgp-vermittelten Mechanismen der Wirkstoffresistenz. Dadurch konnte ein neuer potenzieller Mechanismus der Wirkstoffresistenz an der BHS entdeckt werden, welcher pharmakologisch durch die Hemmung der Aktin- und Mikrotubuli-Polymerisation oder durch Pgp-Inhibition mit Elacridar gehemmt werden konnte. Neben der etablierten Funktion von Pgp an der luminalen Zelloberfläche der Endothelzellen der BHS, wo der Transporter das Eindringen von Xenobiatika in das Gehirngewebe verhindert, wurde Pgp zudem in der Membran von intrazellulären endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen, in die Pgp-Substrate, wie Chemotherapeutika, sequestriert wurden. Durch die intrazelluläre Sequestrierung kommt es zu einer zusätzlichen Umverteilung von Wirkstoffen weg von molekularen Zielstrukturen. Ein solcher Mechanismus der zellulären Wirkstoff-Kompartimentalisierung wurde zuvor als ein Faktor in der Chemoresistenz in Krebszellen beschrieben. In Publikation 3 wurde die endolysosomale Wirkstoff-Sequestrierung erstmals in Gehirnkapillarendothelzellen der BHS nachgwiesen. Das etablierte hCMEC/D3-MDR1-EGFP Modellsystem ermöglichte es die Pgp-Lokalisation innerhalb und außerhalb der Zelle zu verfolgen und somit die Freisetzung der Pgp-positiven, Wirkstoff-sequestrierenden endolysosomalen Vesikel durch die Endothelzellen nachzuweisen. Die durch die Endothelzellen abgegebenen Arzneimittel-sequestrierenden Vesikel bildeten Ansammlung auf der luminalen (dem Blut zugewandten) Endothelzelloberfläche der BHS und wurden „Barrier Bodies“ genannt. Zudem zeigte die Untersuchung der Endothelzellinteraktion mit frisch isolierten neutrophilen Granulozyten, als eine Komponente des Blutkompartiments, eine Phagozytose-basierte Aufnahme und damit Entsorgung der „Barrier Bodies“ durch die neutrophilen Granulozyten. Der neu entdeckte Mechanismus stellt möglicherweise eine zweite „Verteidigungslinie“ dar, wenn Pgp an der Zelloberfläche der Endothelzellen übersättigt ist. Wie in hCMEC/D3-MDR1-EGFP Zellen und den immortalisierten RBE4-MDR1-EGFP Gehirnkapillarendothelzellen aus der Ratte gezeigt wurde, können weitere Pgp-vermittelte Mechanismen der Wirkstoffresistenz an der BHS den interzellulären Pgp-Transport von Endothelzellen mit höherem zu Endothelzellen mit niedrigem Pgp-Expressionslevel und den Wirkstoff-induzierten Pgp-Transport von intrazellulären frühen endosomalen Pools an die Zelloberfläche umfassen. Diese Mechanismen können der schnellen zellulären Anpassung an erhöhte Arzneimittel- oder zytotoxische Substanzkonzentrationen dienen. Die Untersuchung des Protein-Lokalisations- und Funktionszusammenhangs von Pgp mit Fokus auf das endosomale System in naiver Rattenleber durch Kombination von subzellulärer Fraktionierung, ultrastruktureller Analyse von Gewebeschnitten und Vesikeln und biochemischen Methoden in Publikation 4 ergab eine vorwiegende Pgp-Lokalisation in frühen endosomalen Vesikeln, welche einen endosomalen subzellulären Pgp-Proteinpool darstellen können, welcher potenziell durch xenobiotische Stimuli schnell umverteilt werden kann. Neben der In-vitro-Analyse von BHS-bezognenen Mechanismen der Wirkstoffresistenz wurde in Publikation 5 ein genetisches Mausmodell der Parkinson-Erkrankung mit der Überexpression von humanem alpha-Synuclein (αSyn) verwendet, um molekulare und zelluläre Veränderungen der BHS während des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Dabei wurden Expressionsänderungen von BHS-Proteinen mit wichtigen Funktionen in der immunovaskulären Regulation, der Permeabilität, sowie bei Transport- und Entsorgungs-Mechanismen der BHS in isolierten Gehirnkapillaren der Thy1-αSyn Mäuse festgestellt. Diese Veränderungen können neurodegenerative Prozesse auslösen oder verstärken. Die beschriebenen Ergebnisse legen nahe, dass die Wiederherstellung oder der Erhalt der BHS-Funktion ein potenzieller therapeutischer Ansatzpunkt sein könnte, um den Krankheitsverlauf bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie PD zu verlangsamen oder zu beeinflussen. Das Thy1-αSyn PD-Mausmodell erweist sich somit als gutes Wekzeug um BHS-assoziierte therapeutische Interventionsstrategien zu untersuchen. Publikationen 6 und 7 umfassen Studien zu einer Mechanismen-basierten Behandlungsstrategie von Epilepsien in einem konditionellen Tsc1^GFAP-CKO-Mausmodell genetisch bedingter Epilepsie und dem intrahippocampalen Kainat (IHK)-Mausmodell erworbener mesialer Temporallappenepilepsie. Bei Patienten mit tuberöser Sklerose und im tuberöse Sklerosekomplex (TSC)-Mausmodell ist eine Hyperaktivierung des „mammalian target of rapamycin“ (mTOR)-Signalwegs direkt mit TSC-Mutationen verbunden und trägt zur Krankheitspathologie und der Entwicklung epileptischer Anfälle bei. Während eine Hyperaktivierung des mTOR-Signalwegs auch bei Nagetiermodellen und Patienten erworbener Epilepsie beschrieben ist, sind die Auswirkungen einer Modulation des Signalwegs als Therapiemöglichkeit unklar. Everolimus ist ein allosterischer mTOR-Inhibitor und Rapamycin-Derivat (Rapalog), welches zur Behandlung fokaler Epilepsien bei TSC-Patienten zugelassen ist und bei einem Teil der Patienten wirksam ist. Allerdings kann die Behandlung mit Rapalogen mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden sein. Daher wurde die Wirksamkeit der neuen, gut verträglichen mTOR-Inhibitoren PQR530, 620 und 626 mit einer verbesserten Gehirngängigkeit und mTOR-Inhibition hinsichtlich ihrer antiepileptogenen und antiepileptischen (antianfalls-) Effekte im TSC-Mausmodell für genetische Epilepsie und dem IHK-Mausmodell für erworbene Epilepsie getestet. Während mTOR-Inhibition zu einer deutlichen Reduktion von spontanen wiederkehrenden Anfällen im TSC-Mausmodell führte, war ein solcher Effekt im IHK-Mausmodell erworbener Epilepsie nicht nachweisbar. Im Vergleich zu Everolimus konnte keine verbesserte Wirksamkeit der PQR-Substanzen, welche durch die verbesserte Gehirngängigkeit und Verträglichkeit gute Eigenschaften für die Behandlung von Patienten aufweisen, beobachtet werden, da die Wirksamkeit von Everolimus mit dem verwendeten Behandlungsschema im TSC-Modell bereits bei 100% lag. Die mTOR-Inhibition bei genetisch bedingter Epilepsie ist ein Beispiel für eine Mechanismen- oder Ätiologie-basierte Behandlungsstrategie einer ZNS-Erkrankung. Basierend auf einem netzwerkpharmakologischen Ansatz wurde in Publikation 8 eine weitere Behandlungsstrategie für komplexe ZNS-Erkrankungen mit schlechten Therapiemöglichkeiten im IHK-Modell für erworbene Epilepsie getestet. Für diese Strategie werden Kombinationen von Wirkstoffen ausgewählt, welche voraussichtich an verschiedenen der Erkrankung zugrunde liegenden molekularen Anssatzpunkten wirken. Diese können dann, wie in Publikation 8 am Beispiel des IHK-Modells beschrieben, hinsichtlich ihrer Wirksamkeit zur Verbesserung des Krankheitsverlaufs oder der Entstehungen von ZNS-Erkrankungen in Tiermodellen getestet werden. Eine Umwidmung von bereits für andere Indikationen zugelassenen Wirkstoffen mit bekannten Sicherheitsprofilen kann für die Entwicklung von netzwerkpharmakologischen Therapien hilfreich sein. Eine In-silico-Analyse von Arzneimittel- und Protein-Netzwerk-Wechselwirkungen deutete auf einen synergistischen Effekt der beiden zugelassenen Antiepileptika Topiramat und Levetiracetam hin. Tatsächlich führte die Verabreichung dieser Wirkstoffkombination in der Latenzphase und nach Beendigung der Behandlung zu einer signifikant verringerten Inzidenz und Frequenz von spontan auftretenden wiederkehrenden epileptischen Anfällen im IHK-Mausmodell. Ein entsprechender Effekt war durch die Verabreichung der beiden Wirkstoffe alleine nicht nachweisbar. Somit kann die in Publikation 8 untersuchte Wirkstoffkombination von Topiramat und Levetiracetam eine vielversprechende antiepileptogene Behandlungsstrategie für erworbene Epilepsie darstellen. Ein neuroprotektiver Effekt der Wirkstoffkombination, für welche der Behandlungszeitraum nach einem Gehirninsult eine Rolle spielt, konnte in der Studie jedoch nicht nachgewiesen werden. Eine Genexpressionsanalyse im ipsilateralen Hippocampus von den behandelten IHK-Mäusen und unbehandelten Kontrollmäusen mittels Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung führte zum Nachweis von 19 differentiell exprimierten Genen in den ipsilateralen Hippocampi der behandelten Mäuse. Zwölf dieser regulierten Gene wurden zuvor bereits mit der Epileptogenese in Verbindung gebracht und bilden Ansatzpunkte für zukünftige mechanistische Studien, um die Krankheitspathogenese auf molekularer Ebene besser zu verstehen und die Entwicklung von Therapiemöglichkeiten zu erleichtern.