Inactivation methods to study pathogenesis and possible biomarkers for SARS-CoV-2 infection with focus on neutrophil extracellular traps

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der Erreger der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), verursachte eine globale Pandemie, die zu einer Gesundheits- und Wirtschaftskrise führte. Es wurden mehrere diagnostische und prognostische Biomarker identifiziert, darunter flüchtige organische Verbindungen (VOCs) oder extrazelluläre Neutrophilenfallen (NETs). VOCs sind chemische Verbindungen, die von Geweben eines Organismus während physiologischer und pathophysiologischer Prozesse produziert werden. Je nach Erkrankung verändert sich die VOC-Zusammensetzung in verschiedenen Körperflüssigkeiten und damit auch die erregerspezifische Geruchsspur, die als diagnostisches Hilfsmittel genutzt werden kann. NETs sind DNA-Gerüste, die mit antimikrobiellen Peptiden verziert sind, welche als angeborene Immunantwort auf einen Reiz von einem aktivierten Neutrophil ausgestoßen werden. Es ist bekannt, dass der Grad der NET-Marker mit der Schwere der COVID-19-Erkrankung beim Menschen korreliert.

Das Ziel der Arbeit war es, die beiden genannten Biomarker als mögliche diagnostische Werkzeuge zu charakterisieren, wobei der Schwerpunkt auf VOCs zur Geruchserkennung und NET-Markern als Schweregradmarker im Frettchen-Tiermodell für Pathogenesestudien lag.

Im ersten Schritt dieser Studie (Kapitel 5.1.) validierten wir die chemische Inaktivierung von SARS-CoV-2 mit β-Propiolacton (BPL) in mit SARS-CoV-2 versetzten Proben sowie Feldproben mit dem Ziel, inaktivierten Speichel von COVID -19-Patienten für ein Spürhundetraining ohne Biosicherheitsmaßnahmen zu verwenden. Eine erfolgreiche Inaktivierung wurde in mit SARS-CoV-2 versetztem Speichel von gesunden Spendern und Zellkulturmedium sowie in Feldproben von COVID-19-Patienten unter Verwendung von 0,1 % BPL, gepuffert mit NaHCO3, bei einer Temperatur von 2–8 °C für 1 Stunde bzw. 71 Stunden (+/- 1 Std.) nachgewiesen. Anschließend wurde natürlich toxisches BPL durch ein- oder zweistündige Inkubation bei 37 °C zu einem ungiftigen Derivat hydrolysiert. Wir erreichten eine erfolgreiche Inaktivierung mit einer Virustiterreduktion von bis zu 10^4 TCID50/ml für beide Inaktivierungszeiten, indem wir Virustitration und Virusisolierung als Verifizierungsmethoden verwendeten.

In unserem zweiten Ziel (Kapitel 5.2.) haben wir den Einfluss der BPL-Behandlung auf die VOCs in den Speichelproben von COVID-19-Patienten getestet, die mit unserem zuvor validierten BPL-Inaktivierungsprotokoll inaktiviert wurden. Darüber hinaus testete diese Pilotstudie die Fähigkeit trainierter Spürhunde, zwischen inaktivierten SARS-CoV-2-infizierten Proben und Speichel von gesunden Spendern zu unterscheiden. Wichtig ist, dass trainierte Hunde innerhalb einer Woche mit einer durchschnittlichen Erkennungsrate von 94 %, einer diagnostischen Sensitivität von über 82 % und einer diagnostischen Spezifität von über 96 % zwischen infizierten und nicht infizierten Proben unterscheiden konnten. Daher wurde keine Auswirkung der BPL-Behandlung auf die VOCs bestätigt.

In-vivo-Modelle sind in Infektionsstudien unerlässlich, um grundlegende biologische Mechanismen aufzuklären, und von besonderer Bedeutung in Notfallsituationen, wie dem Ausbruch einer Infektionskrankheit.

Um infektiöse Proben aus Tierversuchen zur Charakterisierung des Schweregradmarkers von BSL-2/3 auf niedrigere Biosicherheitsstufen zu übertragen, ist in der Regel eine Genehmigung einer internen Validierung der Pathogeninaktivierung durch die jeweilige Behörde erforderlich. Daher wurde im dritten Teil dieser Studie (Kapitel 5.3.) die SARS-CoV-2-Inaktivierung mit 4 % Formaldehyd (FA) und 5 % Glutaraldehyd (GA) in Organen kleiner Labortiere validiert. Eine vollständige Virusinaktivierung in allen SARS-CoV-geimpften Geweben und experimentell infizierten Geweben wurde mit 4 % FA oder 5 % GA nach 72 h bei RT mit einem Gewebe-zu-Fixiermittel-Verhältnis von 1:20 erreicht, da kein zytopathischer Effekt (CPE) in Vero E6-Zellen nach 5 bis 7 dpi auftrat. Wir zeigten eine Titerreduktion von bis zu 10^2,30 TCID50/ml in gespikten Geweben und 10^3,80 in Geweben von experimentell infizierten Tieren bis zu einer Dicke von 10 mm bzw. 8 mm, unabhängig vom Proteingehalt. Hier haben wir auch die Vorteile der Tissue-Spiking-Methode als zeiteffiziente und nachhaltige Alternative zu Tierversuchen hervorgehoben.

Im vierten Schritt (Kapitel 5.4.) wollten wir junge Frettchen als Tiermodell für eine SARS-CoV-2-Infektion evaluieren. Junge Frettchen, die intratracheal mit SARS-CoV-2 infiziert waren, zeigten keine signifikanten klinischen Symptome und eine sehr vorübergehende Infektion, die auf die oberen Atemwege beschränkt war. Der Nachweis von viralem Antigen in den Nasenmuscheln war mit einer Epithelschädigung und dem Einstrom von Entzündungszellen verbunden, einschließlich aktivierter Neutrophilen, die neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freisetzen. Junge Frettchen erwiesen sich als geeignetes Modell für Studien zur leichten oder asymptomatischen COVID-19-Infektion beim Menschen, einem Krankheitsverlauf, der meist bei Kindern beschrieben wird.

Im fünften Teil (Kapitel 5.5.) wurde die Auswirkung der Fixierung mit mehreren Chemikalien auf die Effizienz der Antikörperfärbung von NETs mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Daher wurden menschliche Neutrophile mit Phorbol 12-Myristat-13-Acetat (PMA) stimuliert und mit Glutaraldehyd (GA), Methanol oder Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Der Einfluss chemischer Fixiermittel wurde auf drei ausgewählte Neutrophilen- oder NET-Marker beobachtet: Myeloperoxidase, dann-Histon-1-Komplex und citrulliniertes Histon H3 (H3cit). Unsere Daten zeigten, dass eine starke Autofluoreszenz nach GA-Behandlung und Fixierung mit 100 % Methanol zu sichtbaren Zellschäden führte. Die Fixierung mit PFA hatte unabhängig von der Inkubationszeit keinen Einfluss auf die Färbeeffizienz mit Myeloperoxidase oder dann DNA-Histon-1-Komplex-Antikörper. Für die Färbung von H3Cit wurde jedoch eine maximale Fixierungszeit von 30 Minuten empfohlen.

In unserem letzten Schritt (Kapitel 5.6.) konzentrierten wir uns auf die Charakterisierung junger und älterer Frettchen als Tiermodelle für eine SARS-CoV-2-Infektion mit Schwerpunkt auf der NET-Bildung und unter Verwendung der oben genannten optimierten Protokolle. Ältere Frettchen, die ähnlich wie die jungen Frettchen in Kapitel X intratracheal infiziert waren, zeigten leichte bis mittelschwere klinische Symptome, eine verlängerte Virus-RNA-Abgabe in den oberen Atemwegen und schwerwiegendere pathologische Veränderungen in der Lunge. Daher sind ältere Frettchen ein relevantes Modell für die altersabhängige COVID-19-Pathogenese. Trotz erhöhter NET-Bildung in der Lunge zeigten die Tiere keinen starken Phänotyp für NETs und sind daher nur bedingt als Tiermodell für die mit NETs assoziierte SARS-CoV-2-Pathogenese beim Menschen geeignet.

Zusammenfassend ermöglichte diese Studie die Charakterisierung von zwei Biomarkern für SARS-CoV-Infektionen: VOCs als Möglichkeit für diagnostische Zwecke über Spürhunde und NETs als Schweregradmarker im experimentellen Frettchenmodell. Während die Verwendung von VOCs zur Erkennung von Dufthunden mit BPL-inaktivierten Proben erfolgreich bestätigt wurde, konnte NETs als Marker für den Schweregrad von COVID-19 bei Frettchen nicht bestätigt werden. Frettchen sind daher nur bedingt geeignet, die Rolle von NETs bei der SARS-CoV-2-Infektion genauer zu untersuchen.