Organ cultures as a tool to investigate virus-host-interactions at epithelial structures

Das Ausmaß der Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen variiert bisher sowohl in Bezug auf verschiedene Epithelien des Geflügels als auch zwischen verschiedenen aviären Viren. Dabei kommt den Epithelzellen eine besondere Rolle im frühen Infektionsprozess, als auch bei der initialen Bekämpfung viraler Erkrankungen zu. AMPV, NDV und AIV stellen drei ökologisch bedeutsame Viruserkrankungen des Nutzgeflügels dar, die zu milden bis schweren Respirationserkrankungen wie auch Einbrüchen in der Legeleistung führen können. Daher ist es wichtig, das Wissen dieser Erreger-Wirt-Interaktionen sowohl am Epithel des Respirations- als auch des Reproduktionstrakts zu erweitern, um in Zukunft mögliche neue Interventionsstrategien entwickeln zu können und somit die Tiergesundheit zu verbessern und wirtschaftliche Verluste zu reduzieren.
Da die Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen unter in vivo Bedingungen schwierig durchzuführen ist, sind verschiedene Fragestellungen bisher ungeklärt. Organkulturen haben sich als geeignete Modelle erwiesen, um diese Interaktionen an Schleimhautoberflächen genauer zu untersuchen. Dieses in vitro Infektionsmodell erlaubt die Untersuchung von Virusinfektionen am voll entwickelten Epithel, wie es in vivo vorhanden ist, und ermöglicht somit im Vergleich zu Zellkulturexperimenten verlässlichere Rückschlüsse. Darüber hinaus leisten Organkulturen, als geeignete Alternativmethode, einen Beitrag zur Reduzierung von Tierversuchen im Sinne des 3R Prinzips. In der Vergangenheit wurden vor allem Trachealring-Organkulturen (TOC) verwendet, um das Zusammenspiel verschiedener Viren mit dem oberen Respirationstrakt näher zu beleuchten, während über virale Interaktionen mit dem Reproduktionstrakt vergleichsweise wenig bekannt ist. Um dieses Defizit zu verringern, wurden in dieser Studie TOC- und Ovidukt-Organkulturen (OOC) von Puten ausgewählt, um die Virus-Wirt-Interaktionen von AMPV und NDV, zwei weltweit wichtigen Viren, die sowohl den Respirations- als auch den Reproduktionstrakt infizieren können, zu betrachten.
Ziel dieser Studie war es, nicht nur mögliche Unterschiede der Erreger-Wirt-Interaktionen an den Epithelien des Respirations- und Reproduktionstrakts festzustellen, sondern auch zwischen verschiedenen Virusstämmen. Dazu wurden ein AMPV-Subtyp A (AMPV-A) und ein AMPV-Subtyp B (AMPV-B) Stamm, sowie der NDV Herts`33 (NDV-HS) und der NDV-Komarow Stamm (NDV-KO) ausgewählt.
Für die 2. Studie wurden die Virus-Wirt-Interaktionen eines atypisch virulenten LPAIV H3N1-Stammes untersucht, der in Legehennenbeständen zu ungewöhnlich hohen Mortalitätsraten sowie starken Legeleistungseinbrüchen führte. Die Zielsetzung war daher, diesen H3N1 Stamm unter in vitro Bedingungen zu untersuchen und um dessen hohe Virulenz im TOC-Modell zu bestätigen. Dafür wurden TOCs von Hühnern hergestellt und zusätzlich ein moderat virulenter H9N2 als Vergleichsstamm ausgewählt. Basierend auf den Felddaten und vorausgegangener in vivo Experimente, wurde zusätzlich der mögliche Einfluss des Genotyps und des Alters auf die H3N1 Infektion untersucht. Dazu wurden TOCs zum Einen von Hühnern des Legetyps (LTOCs) als auch des Masttyps (BTOCs) wie auch von Hühnerembryonen (eTOCs) und 2 Wochen alten Tieren (wTOCs) verwendet.
Um Unterschiede in den Erreger-Wirt-Interaktionen festzustellen, wurden folgende Parameter untersucht: die Virusreplikation mittels qRT-PCR, die virale Antigenverteilung mittels Immunhistochemie, die Induktion von Ziliostase mittels Ziliostase-Assay und das Auftreten von Läsionen mittels Histologie. Da der angeborenen Immunantwort, als erste Verteidigungslinie and er Schleimhautoberfläche des Wirtes gegen Virusinfektionen, eine wichtige Rolle zukommt, wurde darüber hinaus die mRNA-Expression von drei wichtigen antiviralen Parametern (iNOS, IFN-λ, IFN-α) des angeborenen Immunsystems mittels qRT-PCR bestimmt.
Basierend auf den Ergebnissen unserer 1. Studie gehen wir von einer höheren Empfänglichkeit der Trachealschleimhaut im Vergleich zum Epithel des Eileiters für AMPV- und NDV-Infektionen aus, da in den TOCs signifikant höhere Viruslasten und schwerere histopathologische Veränderungen gefunden wurden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der signifikant erhöhten IFN-λ Expression in OOCs gegenüber den TOCs (p < 0.05). Aufgrund der antiviralen Eigenschaften von IFN-λ lässt dies einen besseren Schutz der Oviduktschleimhaut verglichen mit der Trachealschleimhaut vermuten. Das mRNA-Expressionsniveau aller fünf untersuchten importin-α Isoformen war in TOCs vorwiegend herunterreguliert, während in OOCs eine Hochregulierung festgestellt wurde. Auch diese Ergebnisse erklären möglicherweise die höhere Empfänglichkeit des Respirationstraktes, da
Importine nicht nur den intranukleären Transport viraler Proteine, sondern auch den Eintritt von Molekülen, die an den Interferon genutzten Signalwegen beteiligt sind, vermitteln.
Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse, basierend auf der höheren Viruslast und der stärkeren Induktion von Zilienverlust und des Abflachens der Epithelzellen, auf eine höhere Virulenz von AMPV-B und NDV-HS gegenüber ihren Vergleichsstämmen hin. Die Virulenzunterschiede zwischen den beiden untersuchten AMPV- und NDV-Stämmen könnten auf die unterschiedliche Fähigkeit, die angeborene Immunantwort zu beeinflussen, zurückzuführen sein. Für NDV wurde die hemmende Wirkung verschiedener viraler Proteine auf die zellulären Signalwege von Interferonen beschrieben, welche eine verminderte Interferon-Antwort zur Folge hat. Im Vergleich zu NDV ist über die Virulenzfaktoren von AMPV weniger bekannt, jedoch ist die inhibitorische Wirkung des P-Proteins auf die Typ-I-IFN-Expression beschrieben.
Die Ergebnisse der 2. Studie unterstreichen die Unterschiede in der Virulenz von zwei LPAIV-Stämmen in Hühner TOCs. Es wurde gezeigt, dass die H3N1 Infektion in TOCs höhere Viruslasten induziert und im Vergleich zum H9N2-Stamm zu einer stärkeren Ziliostase sowie zu schwereren histopathologischen Läsionen führt. Diese Ergebnisse korrelieren mit der höheren Expression von iNOS, IFN-λ und IFN-α, nach H9N2-Infektion im Vergleich zu H3N1. Genotyp-bedingte Unterschiede traten vor allem bei der Expression von IFN-λ und iNOS zwischen LTOCs und BTOCs auf. Der Einfluss des Alters zeigte sich darin, dass eTOCs anfälliger für LPAIV-Infektionen sind, als wTOCs, da sie eine höhere Virusreplikation und schwerere histopathologische Läsionen aufwiesen. Es ließ sich zudem eine signifikant stärkere Hochregulierung von iNOS und IFN-λ im Vergleich zu IFN-α feststellen (p < 0,05). Dieses Ergebnis weißt auf die besondere Bedeutung der Typ-III-Interferone an Schleimhautoberflächen aufgrund ihrer auf Epithelien begrenzten Rezeptorverteilung hin.
Insgesamt erweitert diese Studie das Wissen über die Virus-Wirt-Interaktionen an verschiedenen Schleimhautoberflächen des Geflügels und liefert gleichzeitig Ansätze für weitere Studien zu diesem Thema. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Organkulturen ein effizientes in-vitro Infektionsmodell darstellen, um diese Interaktionen zu untersuchen und zu vergleichen. Darüber hinaus ist dieses Modell geeignet, sowohl den Einfluss der wirtsabhängigen als auch der virusbedingten Faktoren zu detektieren. Unsere Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass das virale Zusammenspiel an Schleimhautoberflächen durch den Gewebetyp, den Genotyp und das Alter sowie durch verschiedene Viren und Virusstämme mit unterschiedlicher Virulenz beeinflusst wird. Weitere Studien sind nötig, um die genauen Mechanismen der Virus- Wirt-Interaktionen an Epithelien besser zu verstehen und somit in Zukunft bestehende Bekämpfungsstrategien gegen virale Infektionen zu verbessern beziehungsweise mögliche neue Maßnahmen zu entwickeln.