Role of host determinants in the replication cycle of the hepatitis E virus

Wißing, Michael, Hermann

Dissertation 2023 CC BY 4.0

Published

Role of host determinants in the replication cycle of the hepatitis E virus

German
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Das Hepatitis E-Virus (HEV) ist ein lange vernachlässigtes Virus und der weltweit häufigste Erreger der akuten viralen Hepatitis beim Menschen. HEV-Infektionen verlaufen bei Gesunden in der Regel asymptomatisch und selbstlimitierend, können aber bei Patienten mit bereits bestehenden Lebererkrankungen zu einer fulminanten Hepatitis fortschreiten und führen bei Schwangeren zu hohen Sterblichkeitsraten. Bei immungeschwächten Patienten, wie z. B. Organempfängern, verläuft die Infektion häufig chronisch mit einer sich schnell entwickelnden Leberzirrhose. Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass HEV eine sehr heterogene hypervariable Region (HVR) enthält, die größere genomische Umstrukturierungen, einschließlich der Insertion von Wirtsgenen, tolerieren kann. Sie scheinen die Virusreplikation zu beeinflussen und werden häufiger bei chronisch infizierten Patienten beobachtet. Ihre molekulare Funktion im HEV-Genom sowie mögliche Zusammenhänge mit der Chronizität und einem Behandlungsversagen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. In dieser Arbeit wurden Proben eines chronisch infizierten Patienten und HEV-Sequenzen in öffentlichen Datenbanken auf das Vorhandensein von Insertionen und genomischen Umstrukturierungen in der HVR untersucht. Dabei wurden neuartige Insertionen, einschließlich von Interferon stimulierten Genen abgeleitete Sequenzen entdeckt, in ein reverses gentisches System kloniert und ihre Auswirkungen auf die virale Fitness in vitro analysiert. Die Konstrukte, die die Insertion enthielten, veränderten die Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit Ribavirin nicht, steigerten jedoch die virale Replikationskapazität und produzierten höhere Virustiter im Vergleich zum HEV-Elternstamm ohne HVR-Insertion. Alle Insertionen enthielten eine erhöhte Anzahl der positiv geladenen Aminosäure Lysin, welche für die Bildung von Kernlokalisierungssignalen (engl. nuclear localization signal, NLS) erforderlich ist. Das NLS wurde als potenzielles gemeinsames molekulares Muster in allen Insertionen identifiziert, und die Störung der NLS-Sequenz durch Mutagenese im prototypischen HEV-3 Stamm Kernow-C1-p6 reduzierte die virale Fitness. Es wurden künstliche Insertionen erzeugt, die die HVR-Insertionen in Länge, Struktur und NLS nachahmten, aber die stimulierende Wirkung der Inseritonen nur teilweise reproduzieren konnten. Es zeigte sich jedoch, dass Mutationen in der Methlytransferase-Domäne in Zusammenfassung 4 Kombination mit viralen Determinanten in der HVR-Sequenz synergistisch wirken und den Replikationsvorteil rekapitulieren können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mehrere im Patienten indentifizierte Insertionen in der HVR die Replikation steigern konnten und synergistisch wirkende Determinanten für die verbesserte virale Fitness innerhalb und außerhalb des HVR identifiziert wurden. Diese Ergebnisse sowie die konstruierten revers-genetisches Systeme mit Insertionen in der HVR werden dazu beitragen, die zugrundeliegenden Prinzipien der viralen Anpassung von HEV durch das Inserieren von Wirts- und Viralensequenzen während des klinischen Verlaufs der Infektion zu verstehen.

The hepatitis E virus (HEV) is a long-neglected pathogen and the major causative agent of acute viral hepatitis in humans worldwide. HEV infections are usually asymptomatic and self-limiting in healthy individuals, but can progress to fulminant hepatitis in patients with pre-existing liver disease and leads to high mortality rates in pregnant women. The infection in immunocompromised patients such as organ recipients frequently progresses to chronicity with rapidly developing cirrhosis. Recent reports suggest that HEV contains a very heterogeneous hypervariable region (HVR), which can tolerate major genomic rearrangements, including insertions of host genes. They seem to impact viral replication and are more frequently observed in chronically infected patients. However, their molecular function in the HEV genome as well as their association to chronicity and possibly treatment failure is not fully understood. In this thesis, samples of a chronically infected patient and HEV sequences in public databases were analyzed for the presence of insertions and genomic rearrangements in the HVR. Thereby, novel insertions, including interferon-stimulated gene-derived sequences were discovered, cloned into a reverse-genetic system and their impact on viral fitness was analyzed in-vitro. The insertion containing constructs, did not alter the sensitivity against the treatment with ribavirin, but increased the viral replication capacity and produced higher viral titers compared to the parental HEV strain without HVR insertion. All insertions were enriched in the usage of the positively charged amino acid lysine, which is required for the formation of nuclear localization signals (NLS). The NLS was identified as potential common molecular pattern in all insertions and the disruption of the NLS sequence in to prototypic HEV-3 strain Kernow-C1-p6 reduced viral fitness. Artifical insertions were generated, mimicking the HVR insertions in length, structure and NLS, but could only partially rescue the stimulating effect of the insertions. However, mutations in the methyltransferase domain were shown to synergistically act in combination with viral determinants in the HVR sequence and could recapitulate the replication enhancing effect of insertions. In conclusion, several patient-derived insertions in the HVR were able to increase the HEV replication and synergistically acting determinants for the enhanced viral fitness were identified Summary 2 in and outside of the HVR. These results as well as the created toolbox of insertion containing reverse-genetic constructs will help to understand the underlying principles of viral adaptation by host- and viral-sequence snatching of HEV during the clinical course of infection.