Pharmacomicrobiomics in canine idiopathic epilepsy and its behavioral comorbidities

Watanangura, Antja

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Pharmacomicrobiomics in canine idiopathic epilepsy and its behavioral comorbidities

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Die idiopathische Epilepsie ist eine häufige neurologische Krankheit bei Hunden, deren zugrunde liegende Ursache noch nicht identifiziert wurde. Eine Fülle von Hinweisen zeigt, dass die Darmmikrobiota als Teil der Mikrobiota-Darm-Hirn-Achse möglicherweise teilweise am Pathomechanismus der Epilepsie beteiligt sind. Die idiopathische Epilepsie wird in der Regel lebenslang mit Antiepileptika behandelt, wobei Phenobarbital und Imepitoin das Mittel der ersten Wahl ist. Allerdings werden nicht alle Hunde mit Epilepsie durch medikametnöse Behandlung anfallsfrei. Zwei Drittel der Patienten haben trotz Behandlung mit mindestens zwei geeigneten Antiepileptika weiterhin Anfälle, was als Arzneimittelresistenz bezeichnet wird. Bei der idiopathischen Epilepsie beim Hund ist weitgehend anerkannt, dass mehr als zwei Drittel der Patienten Verhaltenskomorbiditäten haben, wie zum Beispiel Angstverhalten und Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung sowie kognitive Dysfunktion. Diese Komorbiditäten sind bei Hunden mit arzneimittelresistenter Epilepsie noch ausgeprägter. Die bisherige Behandlung der idiopathischen Epilepsie und ihrer Verhaltenskomorbiditäten haben beim Hund bisher keine ausreichend wirksame Erfolge bei allen Patienten erbracht. Ziel dieses Projekts war es, unser Verständnis für die Verbindung zwischen dem gastrointestinalen Mikrobiom unter therapeutischen Bedingungen, auch als 'Pharmacimicrobiomics' bezeichnet, und der Pathophysiologie der idiopathischen Epilepsie bei Hunden zu vertiefen, um neuartige Strategien zur Epilepsietherapie und alternative Behandlungen für die Verhaltenskomorbiditäten zu entwickeln.

Ich begann dieses Projekt mit einem systematischen Überblick über die Effekte von Ernährung bei idiopathischer Epilepsie beim Hund (Teil I). Ernährung ist ein weithin bekannter Faktor, der das gastrointestinale Mikrobiom beeinflussen kann und wird als zusätzlicher Faktor zur Verbesserung der Epilepsietherapie betrachtet. Es ist seit geraumer Zeit allgemein bekannt, dass eine ketogene Diät erfolgreiche Ergebnisse bei der Anfallskontrolle bei menschlichen Patienten erzielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein systematischer Übersichtsartikel über potenzielle ernährungsphysiologische Intervention bei epileptischen Hunden geschrieben. Nach einer umfangreichen Überprüfung von Artikeln wurden allein MCT-angereicherte Diäten als wissenschaftlich zufriedenstellend in der veterinärmedizinischen Praxis validiert. Ernährung, mit ihrem potenziell positiven Einfluss auf die Kontrolle epileptischer Anfälle, der auf dem Effekt auf die gastrointestinalen Mikrobiota basiert, spielt auch eine Rolle bei der Modifikation der pharmakokinetischen Eigenschaften von Antiepileptika.

In Teil II der PhD These wurde die Auswirkungen von Phenobarbital auf die taxonomischen und funktionalen Veränderungen der Darmmikrobiota und das Verhalten von Hunden mit idiopathischer Epilepsie nach der Verabreichung von Phenobarbital über 90 Tage untersucht. Die Studie zeigte, dass Phenobarbital die Mikrobiota sowohl taxonomisch als auch funktional beeinflussen kann, indem es zu einer Erhöhung der Konzentration von kurzkettigen Fettsäuren führt und den Glukose- und Proteinstoffwechsel der Darmmikrobiota verändert. Auffällig war, dass Hunde, die auf Phenobarbital ansprachen, signifikant höhere Butyrat-Konzentrationen aufwiesen im Vergleich zu Hunden, die nicht auf Phenobarbital ansprachen, was auf seine potenzielle Bedeutung für die Anfallskontrolle hinweist. Dies könnte auf die Rolle von Butyrat als effiziente Energiequelle sowie seine entzündungshemmenden und neuroprotektiven Effekte zurückzuführen sein. Darüber hinaus führte Phenobarbital auch zu einer Verbesserung von Angstverhalten sowie Trainierbarkeit bei epileptischen Hunden. Daher könnten Unterschiede in den funktionellen Reaktionen der Mikrobiota der Schlüssel zwischen wirksamen und unwirksamen Ergebnissen von Epilepsietherapie sein.

Um in Teil III das Rätsel der potenziellen Kommunikation der Mikrobiota-Darm-Hirn-Achse bei Epilepsie näher zu untersuchen, wurde ein In-vitro-Experiment durchgeführt, bei dem Neuronen aus dem Plexus Myentericus von Meerschweinchen fäkalem Supernatant von epileptischen Hunden ausgesetzt wurden. Zusätzlich wurde der Effekt von Phenobarbital auf die Aktivierung von Neuronen aus dem Plexus myentericus untersucht und die Konzentration kurzkettiger Fettsäuren in der Fäkallösung wurde gemessen. Diese Studie zeigte, dass Fäkallösung diese Neuronen aktivieren konnte, was zu unterschiedlichen Ergebnissen abhängig vom Therapiestatus führte und möglicherweise mit der Konzentration kurzkettiger Fettsäuren zusammenhängt. Diese Untersuchung schließt eine wesentliche Lücke und ebnet den Weg für die Frage, ob das aktivierte Aktionspotenzial Einfluss auf die Gehirnaktivität hat.

In der letzten Studie (Teil IV) meiner PhD These führte ich eine Pilotstudie durch, die darauf abzielte, die Mikrobiota durch Fäkaltransplantation bei Hunden mit medikamentenresistenter Epilepsie zu modulieren. Dabei wurde ein Rektal-Einlaufverfahren angewendet und Transplantationsmaterial von einem Spender, der eine gut kontrollierte Epilepsie ohne Verhaltensveränderung aufwies zum medikamentenresistenten Empfänger übertragen. Diese Studie zeigte, dass die Fäkaltransplantation zu einer Verbesserung der Verhaltenskomorbiditäten führte, die möglicherweise mit Veränderungen der Neurotransmitter in Verbindung stehen. Darüber hinaus hatte die Transplantation nur einen minimalen Einfluss auf die Anfallskontrolle. Diese Ergebnisse geben wichtige Einblicke in das Potenzial der Fäkaltransplantation als neuartiger therapeutischen Ansatz zur Linderung von Verhaltensstörungen.

Dieses Forschungsprojekt vertiefte das Verständnis für die Pathophysiologie der idiopathischen Epilepsie beim Hund, indem es die Beteiligung der Darmmikrobiota, ihrer Produkte und ihrer Auswirkungen auf den Pathomechanismus der idiopathischen Epilepsie beim Hund und den damit assoziierten Verhaltenskomorbiditäten aufzeigt. Diese Ergebnisse unterstützen einen neuartigen therapeutischen Ansatz auf der Grundlage des Mikrobiota-Darm-Hirn-Achsen-Prinzips.

An increasing amount of evidence showed that gastrointestinal microbiota as part of microbiota-gut-brain axis could influence or be partly associated in the pathomechanism of epilepsy. Idiopathic epilepsy is typically treated lifelong with antiseizure drug(s) with phenobarbital and imepitoin being primary drugs of choice in veterinary medicine. However, not all dogs with epilepsy achieve seizure-freedom. Around two out of three of these dogs with epilepsy continue to have seizures despite treatment with at least two appropriate antiseizure drugs, so called drug-resistant epilepsy. In canine idiopathic epilepsy, it is widely acknowledged that over two-thirds of patients experience behavioral comorbidities, such as fear- and anxiety-like behavior, attention deficit hyperactivity disorder, and cognitive dysfunction. These comorbidities are even more pronounced in dogs with drug-resistant epilepsy. To date, treatments for canine idiopathic epilepsy and its behavioral comorbidities have not yet yielded a sufficiently effective outcome.

The aim of this project was to enhance our understanding of the association between gastrointestinal microbiota, epilepsy and therapeutics, of the 'pharmacomicrobiomics'. This endeavor aims to provide new targets for epilepsy management strategies, with a focus on alternative treatments for the associated behavioral comorbidities.

I started this project with a systemic review of the evidence of nutrition in canine idiopathic epilepsy (Part I). Nutrition is a well-known factor affecting gastrointestinal microbiota and is considered an additional factor to enhance epilepsy management. It has been widely recognized for a considerable duration of time that the ketogenic diet yields successful outcomes in seizure control among human patients. After a systematic literature review, only MCT-enriched diets possess a satisfactory level of scientific evidence within the field of veterinary nutrition. In addition, nutrition, with its potential positive impact on controlling epileptic seizures rooted in the effects on gastrointestinal microbiota, also plays a role in modifying the pharmacokinetic properties of antiseizure drugs.

In Part II, I studied the effects of phenobarbital on taxonomic and functional gastrointestinal microbiota alterations and behavior of dogs with idiopathic epilepsy after administration of phenobarbital for 90 days. The study showed that phenobarbital could impact microbiota both taxonomically and functionally by leading to an increase of short-chain fatty acids levels and alteration of glucose and protein metabolism of gastrointestinal microbiota following elevated abundance of the functional genes. Notably, phenobarbital responsive dogs exhibited significantly higher levels of butyrate compared to phenobarbital non-responsive dogs, indicating its potential importance for seizure control. This could be attributed to butyrate's role as an energy source or to its anti-inflammatory and neuroprotective effects. In addition, phenobarbital treatment resulted in an improvement of fear- and anxiety-like behavior and trainability in dogs with epilepsy. Consequently, differences in microbial functional reactions could be the key determinant between effective and ineffective outcomes of epilepsy treatments.

In Part III, the enigma surrounding the potential communication of the microbiota-gut-brain axis in epilepsy was further studied. An in vitro experiment was conducted using cultured myenteric neurons from guinea pigs exposed to fecal supernatants from epileptic dogs. Moreover, the effect of phenobarbital on myenteric neuron activation was studied and the concentration of short-chain fatty acids in the fecal supernatants were measured. This study unveiled that fecal supernatants could activate myenteric neurons differently, depending on disease or therapeutic status of the fecal donor, potentially linked to the concentration of short-chain fatty acids. This investigation bridges a critical gap and paves the way for the subsequent question of whether the activated action potential can propagate to the brain.

In the last study (Part IV) of my PhD thesis, I conducted a pilot study aimed at modulating the microbiota through fecal microbiota transplantation in dogs with drug-resistant epilepsy, employing a rectal enema procedure using fecal transplant material from a well-drug-controlled epileptic dog free of behavioral comorbidities. This study demonstrated that fecal microbiota transplantation led to an improvement in behavioral comorbidities, potentially linked to neurotransmitter alterations. Furthermore, it exerted a minimal impact on seizure control. These findings provide significant insight into the potential of fecal microbiota transplantation as a novel therapeutic approach to mitigate behavioral impairments.

The involvement of gastrointestinal microbiota, their products, and their impacts within the pathomechanism of both canine idiopathic epilepsy and its associated behavioral comorbidities could be in parts demonstrated in this PhD. These findings provide further evidence for a potential novel therapeutic avenue based on the microbiota-gut-brain axis principle.