Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Identification and characterization of antigenic and immunomodulatory properties of PE and PPE proteins of Mycobacterium tuberculosis

Tuberkulose (TB) stellt nach wie vor eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung dar, von der jedes Jahr Millionen von Menschen betroffen sind und die zahlreiche Todesfälle verursacht. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) gehört TB noch immer zu den zehn häufigsten Todesursachen weltweit. Allein im Jahr 2021 wurden schätzungsweise 10,6 Millionen neue TB-Fälle und 1,6 Millionen TB-bedingte Todesfälle gemeldet. Trotz der laufenden Bemühungen zur Bekämpfung der Tuberkulose weist der einzige zugelassene TB-Impfstoff Bacillus Calmette-Guérin (BCG), der im 20. Jahrhundert entwickelt wurde, nur eine eingeschränkte Wirksamkeit auf. BCG bietet einen teilweisen Schutz gegen schwere Formen der TB bei Kindern, einschließlich TB-Meningitis und Miliartuberkulose. Der Schutz lässt jedoch mit der Zeit nach, und die Wirksamkeit des Impfstoffs bei der Vorbeugung von Lungentuberkulose bei Erwachsenen ist oft nicht mehr ausreichend. Infolgedessen sind Erwachsene nach wie vor anfällig für Tuberkuloseinfektionen, weshalb die Entwicklung wirksamerer Impfstoffe zur Bekämpfung dieser Erkrankung von entscheidender Bedeutung ist. Ein hohes Potential für die Impfstoffforschung hat die PE- (Pro-Glu) und PPE- (Pro-Pro-Glu) Proteinfamilie von Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Diese Proteine haben aufgrund ihrer Bedeutung als Virulenzfaktoren und ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Darüber hinaus sind sie aufgrund ihrer Immundominanz und ihrer Fähigkeit, ein breites Spektrum von Immunreaktionen auszulösen, potente Immunogene und somit vielversprechende Kandidaten für neuartige Tuberkuloseimpfstoffe. Von besonderem Interesse ist die Rolle der PE/PPE-Proteine, die mit dem ESX5-Sekretionssystem (auch bekannt als Typ-VII-Sekretionssystem) assoziiert sind. Das ESX5-System ist für die Sekretion verschiedener PE/PPE-Proteine verantwortlich, darunter PE18 (Rv1788) und PPE26 (Rv1789). Auch PE31 (Rv3477) das mit ESX5 assoziiert ist, ist von besonderem Interesse für diese Forschung. Ziel dieser Studie ist es, die potenzielle Immunogenität der Proteine PE18, PE31 und PPE26 zu untersuchen. Darüber hinaus soll diese Studie zu einem tieferen Verständnis ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften führen, mit besonderem Augenmerk auf ihre Auswirkungen auf neutrophile Granulozyten und sogenannte neutrophil extracellular traps (NETs).

 

Das erste Kapitel dieser Studie umfasst eine gründliche Literaturübersicht über die Rolle von neutrophilen Granulozyten und NETs bei TB. Neutrophile Granulozyten spielen als entscheidender Bestandteil des angeborenen Immunsystems eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Mtb-Infektionen z.B. durch die Produktion von reactive oxygen species (ROS) und die Bildung von NETs als Abwehrmechanismen. Die Rolle der NETs bei TB hat zwei Facetten: Einerseits können NETs bei der Eindämmung der Infektion hilfreich sein, indem sie Mtb wirksam immobilisieren. Außerdem können NETs andere Immunzellen wie Monozyten und Makrophagen an den Ort der Infektion locken und so die Immunantwort weiter verstärken. Andererseits kann eine übermäßige oder dysregulierte NET-Bildung schädliche Auswirkungen haben. Eine übermäßige NET-Produktion kann zu Gewebeschäden und Entzündungen führen, sowie zur Immunpathologie im Zusammenhang mit TB beitragen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Mtb die NET-induzierten Abtötungsmechanismen umgehen kann, indem es die NET-Bildung blockiert oder die NETs sogar zu seinem Vorteil nutzt. Angesichts des komplexen Zusammenspiels zwischen neutrophilen Granulozyten, der ROS-Produktion und der NET-Bildung bei TB ist ein detailliertes Verständnis dieser Mechanismen von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung wirksamer Interventionen, einschließlich Impfstoffen und Therapeutika. Künftige innovative Strategien zur Stärkung der Immunantwort umfassen die Modulation der neutrophilen Granulozytenfunktion und die Kontrolle von NETs.


Im zweiten Kapitel dieser Studie untersuchen wir das Potenzial der drei spezifischen Proteine, PE18, PE31 und PPE26, zur Stimulierung der NET-Bildung. Dazu wurden humane primäre neutrophile Granulozyten aus dem Blut mit diesen Proteinen stimuliert und die Bildung von NET nach 3 Stunden mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass alle drei Proteine einen Anstieg der intrazellulären ROS-Konzentration in den neutrophilen Granulozyten auslösen, was mit einer verstärkten NET-Bildung korreliert. Bemerkenswert ist, dass die Anwesenheit von Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), einem bekannten Aktivator von NADPH-Oxidasen, diesen Effekt noch verstärkt. Wichtig ist, dass trotz der starken NET-Bildung die neutrophilen Granulozyten intakt blieben, was auf eine vitale NET-Bildung hinweist. Diese Beobachtung wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Unsere Ergebnisse werfen ein neues Licht auf die komplizierten Wirt-Pathogen-Interaktionen, die während einer Mtb-Infektion ablaufen, und heben insbesondere die Rolle der oben genannten mykobakteriellen Proteine bei der NET-Induktion hervor. Die immunogenen Eigenschaften dieser Proteine können ein Weg für innovative Ansätze zur Nutzung der durch neutrophile Granulozyten vermittelten Immunreaktionen ebnen und bei der Kontrolle der TB-Pathogenese helfen.


Im dritten und letzten Kapitel untersuchen wir das immunogene Potenzial der Proteine PE18, PPE26 und PE31 bei Menschen und Mäusen. Zunächst bewerten wir die Immunreaktivität dieser Proteine anhand von Seren von TB-Patienten, Interferon Gamma Test (IGRA)-positiven Kontaktpersonen und IGRA-negativen BCG-geimpften gesunden Kontrollepatienten aus dem für TB endemischen Land Mosambik. Unsere Analyse ergab, dass alle drei Antigene in diesen Gruppen eine Immunreaktivität aufwiesen. Darüber hinaus untersuchten wir den Antigen-Recall in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von Personen aus den drei Gruppen und beobachteten einen bemerkenswerten Trend bei der IFNγ- und TNF-Produktion durch CD4+ T-Zelluntergruppen bei IGRA+ Personen. Desweiteren untersuchten wir das immunogene Potenzial dieser Proteine bei gesunden Personen ohne vorherige TB-Exposition. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Proteine eine gewisse Proliferation von PBMC induzierten, was ihre Fähigkeit unterstreicht, auch bei nicht exponierten Personen eine Immunantwort auszulösen. In einem Immunisierungsversuch in der Maus haben wir eine Impfstrategie angewandt, die ein systemisches Priming und ein intranasales Boosting mit jedem Protein zusammen mit dem Adjuvans Quil-A umfasst. Dieser Ansatz führte zu robusten IgG-Antikörperreaktionen im Serum und überwiegend zu IgG-Reaktionen in der bronchoalveolären Lavage. Außerdem wurden antigenspezifische CD4+- und CD8+-Effektor-Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen in der Milz ausgelöst, wobei PE18 zusätzlich in der Lage war, gewebsresidente Gedächtnis-T-Zellen in der Lunge zu induzieren. Um das schützende Potenzial dieser Immunreaktionen zu bewerten, haben wir immunisierte Mäuse mit einer niedrigen Dosis des aerosolisierten Mtb-Stamms H37Rv infiziert. Weder der Mycobacterial Growth Inhibition Assay (MGIA) mit Splenozyten noch die Auszählung lebensfähiger Bakterien in der Lunge zeigten jedoch eine Verringerung des Bakterienwachstums. Zusammenfassend lassen unsere Ergebnisseden Schluss zu, dass diese drei spezifischen PE/PPE-Proteine zwar sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen Immunogenität zeigen, aber unter den getesteten Bedingungen keine schützende Immunität verleihen. Diese umfassende Studie liefert wertvolle Erkenntnisse über die von diesen Proteinen ausgelösten Immunreaktionen und ihre möglichen Auswirkungen auf die Entwicklung von Tuberkulose-Impfstoffen.

Insgesamt bietet diese Studie eine umfassende Bewertung des Potenzials von PE/PPE-Proteinen als neue TB-Impfstoffkandidaten. Die Charakterisierung dieser Proteine in neutrophilen Granulozyten und die Bewertung ihrer Immunogenität bei Menschen und Mäusen unterstreichen ihre Bedeutung für die Auslösung von Immunreaktionen gegen Mtb. Diese Erkenntnisse eröffnen vielversprechende Möglichkeiten für die Entwicklung wirksamer Tuberkulose-Impfstoffe und therapeutischer Interventionen. Es sind jedoch weitere Forschungsarbeiten erforderlich, um das Schutzpotenzial dieser Antigene und ihre Anwendung bei der Tuberkulosebekämpfung vollständig zu erforschen. Das Potenzial der PE/PPE-Proteine, Komplexe zu bilden und synergistische Wirkungen zu zeigen, deutet außerdem darauf hin, dass die Aufnahme von Mitgliedern der PE/PPE-Proteinfamilie in Impfstoffformulierungen deren Immunogenität und Schutz verbessern könnte. Die Forschung auf diesem Gebiet verspricht die Entwicklung neuer TB-Impfstrategien. Da die weltweite Belastung durch Tuberkulose nach wie vor eine große gesundheitliche Herausforderung darstellt, tragen die Erkenntnisse dieser Studie zu den laufenden Bemühungen um die Kontrolle und Ausrottung dieser verheerenden Krankheit bei.

Tuberculosis (TB) continues to pose a significant global health burden, affecting millions of people each year and causing numerous deaths. According to the World Health Organization (WHO), TB remains one of the top 10 causes of death globally, with an estimated 10.6 million new TB cases and 1.6 million TB-related deaths reported in 2021 alone. Despite the ongoing efforts to control TB, the Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine, the only licensed TB vaccine developed in the 20th century, exhibits limitations in its efficacy. BCG provides partial protection against severe forms of TB in children, including TB meningitis and miliary TB. However, its protection wanes over time, and its effectiveness in preventing pulmonary TB in adults is variable. As a result, adults remain vulnerable to TB infection, making it crucial to develop more effective vaccines to combat this disease. One intriguing target for vaccine research lies in the potential of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) PE (Pro-Glu) and PPE (Pro-Pro-Glu) protein families. These proteins have drawn significant attention due to their relevance as virulence factors and their immunomodulatory properties. Moreover, their immunodominance and ability to induce a broad spectrum of immune responses make them potent immunogens, holding significant promise as candidates for novel TB vaccines. Of particular interest is the role of PE/PPE proteins associated with the ESX5 secretion system (also known as the Type VII secretion system). The ESX5 system is responsible for the secretion of various PE/PPE proteins, including PE18 (Rv1788) and PPE26 (Rv1789). Additionally, PE31 (Rv3477) is associated with ESX5 and is of particular interest in this research. This study aimed to explore the potential immunogenicity of PE18, PE31, and PPE26 proteins. Furthermore, this study seeks to gain a deeper understanding of their immunomodulatory properties, with a specific focus on their effects on neutrophils and neutrophil extracellular traps (NETs).


The first chapter of this study involves a thorough literature review on the role of neutrophils and NETs in TB. Neutrophils, as a crucial component of the innate immune system, play a significant role in the host’s defense against Mtb infection employing ROS production and NET formation as defence mechanisms. The role of NETs in TB is two-fold. On one hand, NETs can be beneficial in containing the infection by effectively immobilizing Mtb. Furthermore, NETs can recruit other immune cells, such as monocytes and macrophages, to the site of infection, further enhancing the immune response. On the other hand, excessive or dysregulated NET formation can have detrimental effects. Excessive NET production can lead to tissue damage and inflammation, contributing to immunopathology associated with TB. Furthermore, Mtb has also been shown to evade NET-induced killing mechanisms by blocking NET formation or even using NETs to its advantage. Given the complex interplay between neutrophils, ROS production, and NET formation in TB, understanding these mechanisms in detail is crucial for developing effective interventions, including vaccines and therapeutics. Future innovative strategies directed at bolstering immune responses include the modulation of neutrophil function and the control of NETs.


In the second chapter of this study, we delve into the potential of three specific proteins, PE18, PE31, and PPE26, in stimulating NET formation. Here, human primary blood-derived neutrophils were stimulated with these proteins, and NET formation was assessed after 3 hours using confocal fluorescence microscopy. Our findings revealed that all three proteins induced an increase in intracellular ROS levels in neutrophils, which correlated with enhanced NET formation. Notably, the presence of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), a known enhancer of NADPH oxidases, amplified this effect. Importantly, despite robust NET formation, neutrophils remained intact, indicating a vital mode of NET formation. This observation was further confirmed through transmission electron microscopy. These results shed light on the intricate host-pathogen interactions that occur during Mtb infection, specifically highlighting the role of these mycobacterial proteins in NET induction. Taking advantage of these properties could pave the way for innovative approaches to enhance neutrophil-mediated immune responses and aid in the control of TB pathogenesis.


In the third and final chapter, we investigated the immunogenic potential of PE18, PPE26, and PE31 proteins in humans and mice. Initially, we assessed the immunoreactivity of these proteins by using sera from TB patients, interferon gamma release assay (IGRA) positive household contacts, and IGRA negative BCG-vaccinated healthy controls from the TB endemic country of Mozambique. Our analysis revealed that all three antigens exhibited immunoreactivity across these groups. Additionally, we examined antigen-recall responses in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from individuals from these three groups, observing a notable trend in IFNγ and TNF production by CD4+ T cell subsets in IGRA+ household contacts. Furthermore, we explored the immunogenic potential of these proteins in healthy individuals with no prior TB exposure. Our results demonstrated that the proteins induced some proliferation of PBMC, highlighting their capacity to elicit immune responses even in unexposed individuals. Moving to murine models, we employed a vaccination strategy involving systemic priming and intranasal boosting with each protein formulated alongside the Quil-A adjuvant. This approach induced robust IgG antibody responses in sera and predominantly IgG responses in bronchoalveolar lavage. Moreover, antigen-specific CD4+ and CD8+ effector memory T cell responses were triggered in the spleen, with the additional ability of PE18 to induce tissue-resident memory T cells within the lungs. To assess the protective potential of these immune responses, we challenged immunized mice with low-dose aerosolized Mtb strain H37Rv. However, neither the Mycobacterial Growth Inhibition Assay (MGIA) with splenocytes nor the enumeration of viable bacteria in the lung indicated any reduction in bacterial growth. In conclusion, our findings reveal that these three specific PE/PPE proteins, while demonstrating immunogenicity in both human subjects and murine models, do not confer protective immunity under the tested conditions. This comprehensive study contributes valuable insights into the immune responses triggered by these proteins and their potential implications for TB vaccine development.


Taken together, this study provides a comprehensive assessment of the potential of PE/PPE proteins as novel TB vaccine candidates. The characterization of these proteins in neutrophils and the evaluation of their immunogenicity in both humans and mice underscore their significance in eliciting immune responses against Mtb. These findings open promising avenues for the development of effective TB vaccines and therapeutic interventions. However, further research is needed to fully explore the protective potential of these antigens and their application in TB control. Furthermore, the potential of PE/PPE proteins to form complexes and exhibit synergistic effects suggests that incorporating members of the PE/PPE protein family into vaccine formulations may enhance their immunogenicity and protection. Research in this area holds the promise of developing new TB vaccine strategies. As the global burden of TB remains a critical health challenge, the progress made in this study contributes to the ongoing efforts to control and eradicate this devastating disease.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.

Access Statistic

Total:
Downloads:
Abtractviews:
Last 12 Month:
Downloads:
Abtractviews:

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved