Immunhistologische und molekularbiologische Untersuchungen am equinen ex vivo Uterus

Ziel dieser Studie war es, das von Unruh (2022) etablierte ex vivo-Modell zur isolierten Hämoperfusion des equinen Uterus auf seine morphologische Stabilität und Funktionalität auf molekularer Ebene zu untersuchen. Das weitere Ziel war, die Verwendbarkeit der Open-Source-Software QuPath zur Auswertung immunhistochemischer Schnittbilder des equinen Endometriums zu untersuchen. Dafür wurden endometriale Gewebeproben, die aus den extrakorporal perfundierten Uteri (n=12) geschlachteter Stuten zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, mittels qPCR und Immunhistochemie analysiert. Endometriumbiopsie 1 wurde direkt nach Schlachtung entnommen, Probe 2 nach dem Transport ins Labor, sowie Probe 3, 4 und 5 nach 240, 300 und 360 Minuten Perfusionszeit und ein Vollschichtbioptat nach Beendigung der Perfusion. Die Expression der Gene Progesteronrezeptor (PGR), Östrogenrezeptor 1 (ESR1), Oxytocin-Rezeptor (OXTR), Ki67 und Caspase 3 (Casp3) wurde in den ersten fünf Proben im Verlauf bestimmt. Für die Hormonrezeptorgene erfolgte zusätzlich eine Einteilung der Stuten nach Zyklusstand, um einen Einfluss auf die Expression untereinander und im Verlauf zu prüfen. Es ergaben sich die Gruppen Anöstrus (n=4), Östrus (n=4) und Diöstrus (n=4). Auf mRNA-Ebene war in der Gesamtzahl der Uteri eine signifikant niedrigere Expression von PGR zu Zeitpunkt 5 (360 min Perfusionszeit) im Gegensatz zu Zeitpunkt 1 (direkt nach Schlachtung) festzustellen (p < 0,05). Ansonsten ergaben sich bei den Rezeptorgenen weder in der Gesamtzahl noch in den Zyklusstandgruppen signifikante Unterschiede. Zwischen den Gruppen war die Expression von ESR1 und PGR im Anöstrus und Östrus signifikant höher als im Diöstrus. Das Expressionsmuster von Ki67 wies eine abnehmende Tendenz auf und war zu Zeitpunkt 5 signifikant niedriger als zu Zeitpunkt 1 und zu Zeitpunkt 3 und 5 signifikant niedriger als zu Zeitpunkt 2 (p < 0,05). In der Expression von Casp3 war ein signifikanter Anstieg zwischen Zeitpunkt 2 und 3 zu vermerken (p < 0,05), blieb daraufhin aber weitgehend konstant. Zur Bestimmung der Expression auf Proteinebene wurden immunhistochemische Schnitte zum Nachweis von Progesteronrezeptor (PR), Östrogenrezeptor-α (ERα), Oxytocinrezeptor (OXTR), Ki67-Antigen (Ki67) und aktivierter Caspase 3 (Casp3) angefertigt. Dafür wurden alle (Ki67 und Casp3) bzw. die erste und die letzte Probe (Hormonrezeptoren) verwendet. Eine Einteilung nach Zyklusstand erfolgte für die Hormonrezeptoren wie bereits für die qPCR beschrieben. Die Auswertung erfolgte zum einen manuell und zum anderen halbautomatisch mittels der Open-Source- Software QuPath. Es wurden pro Schnitt 200 Zellen jedes Zelltyps (luminale Epithelzellen, Stromazellen, Drüsenzellen) aus mindestens drei Feldern ausgezählt. Anschließend wurden diese Bereiche markiert und durch das Programm ausgewertet. Die Auswertung der Schnitte zum Nachweis von OXTR erfolgte aufgrund des zytoplasmatischen Signals und der inhomogenen Verteilung innerhalb einer Probe deskriptiv. OXTR war in allen Zelltypen des Endometrium exprimiert und es konnte keine offensichtliche Änderung der Expressionsrate im Verlauf festgestellt werden. Die Expression von PR und ERα zeigte einen signifikanten Abfall zwischen Messzeitpunkt 1 und 2 (p < 0,05). Für Casp3 und Ki67 konnten bei keinem der Zelltypen signifikante Veränderungen festgestellt werden.

Sowohl im Vergleich positiver Zellen als auch im Vergleich der Gesamtzahlen, die durch die manuelle Auswertung und die computergestützte Analyse mittels QuPath erhoben wurden, zeigten sich signifikante Unterschiede (p < 0,05). Für eine optimale Auswertung immunhistochemischer Schnitte des equinen Endometrium sind Modulationen und Anpassungen der Einstellungen in der Software nötig. Zusammenfassend zeigten die Uteri eine Erhaltung der Funktionalität und bei den Hormonrezeptoren Stabilität der Expression auf molekularer Ebene über die gesamte Perfusionszeit.