Quantitative Analyse mastitisrelevanter Keimgruppen auf Zitzengummioberflächen und ihre Reduktion durch Melkzeugzwischendesinfektion
Mastitiden sind die aus ökonomischer Sicht bedeutungsvollsten Erkrankungen der Milchkühe. Um die Mastitisinzidenz und somit hohe Behandlungskosten für die Landwirte zu senken und nicht zuletzt auch das Tierwohl zu steigern, sind Mastitispräventionsmaßnahmen nicht nur in der Haltung, sondern auch während des maschinellen Milchentzuges sinnvoll, da eine Übertragung verschiedener euterpathogener Mikroorganismen während des Melkvorgangs über die genutzten Zitzengummis möglich ist, wenn diese durch erregerhaltige Milch oder Verschmutzungen kontaminiert werden. Mikrobiologische Proben von Melkanlagen und Zitzengummis können der Kontrolle dieser Präventionsmaßnahmen und somit auch einer guten Melkhygiene dienen. Aufgrund der erschwerten Zugänglichkeit der Innenseite der Zitzengummioberfläche sowie den geringen Kosten und der hohen Praktikabilität, werden häufig Tupferverfahren zur Probenentnahme genutzt. Da es jedoch oftmals an einer Standardisierung des Verfahrens fehlt, erfolgt meist kein quantitativer Nachweis der Erregerdichte von der Zitzengummioberfläche, sondern ein qualitativer Nachweis vorhandener Erreger. Für eine Standardisierung der Tupferprobenentnahme sind viele Variablen wie beispielsweise der Anpressdruck des Tupfers, das Tupfermaterial, die Feuchtigkeit des Tupfers sowie auch die Feuchtigkeit der zu beprobenden Oberfläche und deren Größe zu berücksichtigen. Daher wurde unter Einbeziehung dieser Faktoren innerhalb der ersten Studie der vorliegenden Dissertation ein multifaktorieller Laborversuch mit dem Ziel durchgeführt, das Tupferverfahren in Anlehnung an DIN 10113-1: 1997-07 zu finden, welches die höchste Keimwiederfindung bei möglichst einheitlichen Ergebnissen erzielt. Zum Vergleich standen innerhalb des Versuchs somit vier verschiedene Tupferprobetechniken: eine Trockentupfer (DS) Technik sowie drei verschiedene Nass-Trockentupfer (WDS) Techniken, die sich hinsichtlich des angewandten Anpressdrucks und des verwendeten Tupfers unterschieden. Mittels jeder Technik wurde eine Probe von einer definierten Fläche von je 12 Zitzengummis aus Acrylnitril-Butadien-Kautschuk genommen, welche zuvor mit Reinkulturen von Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis und Streptococcus agalactiae kontaminiert wurden. Im Anschluss an die Probenentnahme erfolgte ein standardisiertes Verfahren zur Probenverarbeitung im Labor und die Auswertung der Proben nach 24 und 48 Stunden. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass die beschriebenen Faktoren Anpressdruck und Tupferfeuchtigkeit hinsichtlich der Keimwiederfindung durchaus relevant sind, da mittels des WDS-Verfahrens mit hohem Anpressdruck der höchste Erregernachweis von der Oberfläche gelang, wohingegen der Nachweis einzelner Erreger mittels des DS-Verfahrens nicht möglich war. Der Unterschied zwischen der Anwendung von Tupfern aus dem Laborbedarf und Tupfern aus dem Kosmetikbedarf fiel innerhalb der Studie nur gering aus, sodass der Einsatz von Tupfern aus dem Kosmetikbedarf zur Kostensenkung denkbar ist, wenn die Möglichkeit besteht, diese vorab zu sterilisieren. Somit kristallisierte sich im ersten Teil dieser Arbeit das WDS-Verfahren mit hohem Anpressdruck in Anlehnung an DIN 10113-1: 1997-07 als das am besten geeignete Verfahren zur quantitativen Analyse der Erregerdichte auf der Zitzengummioberfläche heraus, wobei sowohl die Anwendung von Einmaltupfern aus dem Laborbedarf als auch die Anwendung von Tupfern aus dem Kosmetikbedarf nach vorheriger Sterilisation denkbar ist. Eine Methode zum quantitativen Nachweis der Erregerdichte von der Zitzengummiinnenfläche ist zur Beantwortung vieler Fragestellungen in der Melkhygiene nötig. Eine dieser Fragestellungen lautet, wie hoch die Keimreduktion auf der Zitzengummioberfläche durch durchgeführte Zwischendesinfektionsmaßnahmen ist. Um dies zu beantworten, wurde im zweiten Teil der Arbeit sowohl ein Labor- als auch ein Feldversuch mittels der oben beschriebenen Probenentnahmetechnik durchgeführt. Der Aufbau des Laborversuchs zur Keimreduktion glich dem der Methodenfindung. Zur Desinfektion wurde ein Sprayverfahren verwendet, welches kostengünstig und mit wenig Material durchzuführen ist, sodass es in Milchviehbetrieben häufig zur Zwischendesinfektion der Melkzeuge genutzt wird. Aus Zeit- und Kostengründen wird hierbei lediglich eine geringe Menge der Desinfektionslösung aufgesprüht und häufig erfolgt nur eine kurze Einwirkzeit dieser, da die Melkzeuge oft bereits direkt nach der Desinfektion an die nächste Kuh angesetzt werden. Um praxisnahe Ergebnisse in der Studie zu erzielen, wurden somit lediglich 1,7 ml Desinfektionslösung genutzt und die Probenentnahme mittels des WDS-Verfahrens erfolgte bereits nach einer Einwirkzeit von 30 s. So wurde anhand von 64 Tupferproben im Labor die Höhe der Keimreduktion bei der Desinfektion mit Peressigsäurelösung (PAS), einem Desinfektionsmittel auf Wasserstoffperoxidbasis oder einer plasmaaktivierten 0,5 Molaren TRIS-Pufferlösung (PABS) verglichen. Um zu prüfen, inwieweit die Erreger allein durch die angewandte Flüssigkeit von den Zitzengummis gespült werden, erfolgte ebenfalls ein Vergleich mit der Anwendung sterilen Wassers. Insgesamt wurde zwar mittels aller Desinfektionsmittel eine signifikante Keimreduktion der verwendeten Erreger nachgewiesen, jedoch würde man sich für eine effektive Desinfektion eine höhere Mikroorganismenreduktion wünschen. Da die besten Ergebnisse innerhalb des Laborversuchs durch PAS und PABS erzielt wurden, wurden während des Feldversuchs nur PAS, PABS und steriles Wasser in zufälliger Reihenfolge an 40 Melkzeugen angewandt. Es erfolgte zwar eine Keimreduktion durch alle Desinfektionsvarianten, jedoch konnte kein signifikantes Ergebnis der Reduktion der Mischflora bei der Beprobung von 160 Zitzengummis festgestellt werden. Somit wurde innerhalb dieser Arbeit eine Tupfermethode gefunden, die für den quantitativen Nachweis der Erregerdichte auf der Zitzengummioberfläche geeignet ist und daher zur Beantwortung verschiedener Fragestellungen in der Melkhygiene und der Mastitisprävention genutzt werden kann. Bei der Prüfung einer Zwischendesinfektion mittels verschiedener Lösungen im Sprühverfahren, konnte so nachgewiesen werden, dass unter den in der Studie gegebenen Bedingungen keine ausreichende Desinfektionswirkung auftritt. Ob verbesserte Ergebnisse durch eine Erhöhung von Desinfektionsmittelmenge und Einwirkzeit erreicht werden können, wäre durch die Durchführung einer erneuten Studie zu überprüfen.
Mastitis is the most important disease of dairy cows from an economic point of view. In order to reduce the incidence of mastitis and thus high treatment costs for farmers and, last but not least, to increase animal welfare, mastitis prevention measures are not only useful in husbandry, but also during mechanical milk removal, since transmission of various udder-pathogenic microorganisms is possible during the milking process via the liners if these are contaminated by milk containing pathogens or soiling. Microbiological samples of milking equipment and liners can serve to control these preventive measures and thus also good milking hygiene. Due to the difficulty of accessing the inside of the liner surface, as well as the low cost and high practicality, swab methods are often used to collect samples. However, since there is often a lack of standardization of the procedure, there is usually no quantitative detection of the pathogen density from the liner rubber surface, but a qualitative detection of pathogens. For standardization of swab sampling, many variables such as the contact pressure of the swab, the swab material, the moisture of the swab, and also the moisture of the surface to be sampled and its size must be considered. Therefore, taking these factors into account, a multifactorial laboratory test was carried out within the first study of the present dissertation with the aim of finding the swab method in accordance with DIN 10113-1: 1997-07 which achieves the highest pathogen recovery with the most uniform results possible. Thus, four different swab sampling techniques were available for comparison within the experiment: one dry swab (DS) technique and three different wet-dry swab (WDS) techniques, which differed in terms of the applied contact pressure and the swabs used. By means of each technique, a sample was taken from a defined area of 12 teat liners each made of nitrile butadiene rubber, which had previously been contaminated with pure cultures of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis and Streptococcus agalactiae. Sample collection was followed by a standardized procedure for sample processing in the laboratory and evaluation of the samples after 24 and 48 hours. The results of the study show that the described factors of contact pressure and swab moisture are quite relevant with regard to the microorganism recovery, since the highest pathogen detection from the surface was achieved by means of the WDS method with high contact pressure, whereas the detection of individual pathogens was not possible by means of the DS method. The difference between the use of swabs from laboratory supplies and swabs from cosmetic supplies was only slight within the study, so that the use of swabs from cosmetic supplies to reduce costs is conceivable if it is possible to sterilize them in advance. Thus, in the first part of this work, the WDS method with high contact pressure based on DIN 10113-1: 1997-07 emerged as the most suitable method for quantitative analysis of the pathogen density on the teat liner surface, whereby both the use of disposable swabs from laboratory supplies and the use of swabs from cosmetic supplies after prior sterilization are conceivable. A method for quantitative detection of pathogen density from the inner surface of the liner is needed to answer many questions in milking hygiene. One of these questions is how high the bacterial reduction on the liner surface is by performed intermediate disinfection measures. To answer this, both a laboratory and a field trial were conducted in the second part of the study using the sampling technique described above. The design of the laboratory experiment for bacterial reduction was similar to that of the method finding. A spray method was used for disinfection, which is inexpensive and requires little material to perform, so it is commonly used on dairy farms for intermediate disinfection of milking equipment. For time and cost reasons, only a small amount of the disinfectant solution is sprayed on and often only a short exposure time is required, since the clusters are often applied to the next cow immediately after disinfection. In order to achieve practical results in the study, only 1.7 mL of disinfectant solution was used and samples were taken using the WDS method after an exposure time of only 30 s. Thus, 64 swab samples were used in the laboratory to compare the level of bacterial reduction when disinfecting with Peracetic Acid Solution (PAS), a hydrogen peroxide-based disinfectant, or a Plasma-Activated 0.5 molar TRIS Buffered Solution (PABS). To test the extent to which pathogens were flushed from the liners by the applied liquid alone, a comparison was also made with the application of sterile water. Overall, although all disinfectants provided significant bacterial reduction of the pathogens used, a higher microbial reduction would be desired for effective disinfection. Since the best results within the laboratory trial were obtained by PAS and PABS, only PAS, PABS and sterile water were applied in random order to 40 milking clusters during the field trial. There was a bacterial reduction by all disinfection variants, but no significant result of reduction of mixed flora was observed while sampling 160 teat liners. Thus, within this work, a swab method was found to be suitable for the quantitative detection of pathogen density on the liner surface and can therefore be used to answer various questions in milking hygiene and mastitis prevention. During testing intermediate disinfection by means of different solutions in a spraying procedure, it could thus be demonstrated that under the conditions given in the study no sufficient disinfection effect occurs. Whether improved results can be achieved by increasing the amount of disinfectant and exposure time would have to be verified by conducting a new study.
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