Vergleich und Entwicklung von Methoden zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Lebensmittelinfektionserregern in Trinkwasser mit rt-PCR-Methoden als Vorbereitung für einen Nachweis über Metagenom-Sequenzierungsverfahren

Einicke, Hanna, Elena

Dissertation 2023 CC BY 4.0

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Vergleich und Entwicklung von Methoden zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Lebensmittelinfektionserregern in Trinkwasser mit rt-PCR-Methoden als Vorbereitung für einen Nachweis über Metagenom-Sequenzierungsverfahren

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Im Sinne des Verbraucherschutzes darf Trinkwasser keine Krankheitserreger übertragen, die bei Verbrauchern zu Infektionen führen. Um diesen mikrobiellen Aspekt zu prüfen, wird das Trinkwasser nach den Vorgaben der Trinkwasserverordnung auf die Anwesenheit ausgewählter Bakterien untersucht, die mit kulturellen Methoden nachweisbar sind und zumeist eine fäkale Kontamination des Wassers anzeigen sollen. Allerdings werden die mit Eintragungen insbesondere fäkaler Natur assoziierten Infektionserreger somit nur indirekt nachgewiesen. Obwohl Überwachungen des Trinkwassers durchgeführt werden, können trinkwasserassoziierte Krankheitsausbrüche daher nicht ausgeschlossen werden. Um dieses Risiko zu minimieren, wurde im Rahmen eines Projekts an dem direkten Nachweis von Lebensmittelinfektionserregern in Trinkwasser geforscht. Dabei sollte ein Metagenom-Sequenzierungsverfahren für den Nachweis entwickelt werden. Für das molekularbiologische Nachweisverfahren müssen die Nukleinsäuren aus den Infektionserregern, nach Möglichkeit gemeinsam aus einer Trinkwasserprobe, gewonnen werden, was den Umfang dieser Studie darstellt. Dabei wird angestrebt, Verluste bei der Gewinnung der Nukleinsäuren sowie eine Selektion eines Parameters zu vermeiden, um eine möglichst akkurate Abbildung des Metagenoms zu erlauben. Die Bakterienspezies Escherichia coli und Enterococcus faecalis sowie Hepatitis E-Viren wurden als Modelle verwendet und Trinkwasserproben zugesetzt. Zunächst wurden verschiedene Methoden zur Gewinnung der Nukleinsäuren aus Bakterien untersucht und entwickelt. Für die Viren wurden verschiedene Verfahren zur Konzentrierung verglichen. Zusätzlich wurden Bakterien und Viren simultan konzentriert und die Nukleinsäuren gemeinsam extrahiert. Zum Nachweis der Nukleinsäuren wurden (RT-)rt-PCR-Methoden verwendet. Verglichen wurden die Verfahren über die Gewinnungseffizienz der Nukleinsäuren, die über Wiederfindungsraten bestimmt wurden. In dieser Studie wurden Daten über Wiederfindungsraten erhoben und es konnte ein Beitrag zur Verbesserung von Gewinnungseffizienzen geleistet werden. Hierauf aufbauend können weitere Forschungen und Optimierung von Methoden erfolgen.

For consumer protection, drinking water must not convey pathogens, which result in infections. In order to assess this microbial aspect, drinking water is tested for the presence of certain bacteria, which can be detected with cultural methods and indicate contamination, mostly of faecal nature, of the water. However, pathogens, which are especially associated with faecal introductions, are detected only indirectly. Therefore, outbreaks of diseases associated with drinking water consumption cannot completely be excluded despite the monitoring of drinking water quality. To minimise this risk of safety, methods for the direct detection of infecting agents were researched in a project. In this project, a metagenome sequencing technique for the detection of pathogens was aimed to be developed. For the molecular biological detection method, nucleic acids need to be extracted from the pathogens, preferably from a single drinking water sample, which was the aim of this study. It was aspired to receive the highest possible recoveries for the nucleic acids and to avoid selection of a parameter to allow an accurate imaging of the metagenome. As models, the bacterial species Escherichia coli and Enterococcus faecalis as well as the virus hepatitis E virus were employed in spiked drinking water samples. Initially, different methods for extracting nucleic acids from bacteria were examined and developed. For concentrating viruses, various methods were compared. Additionally, bacteria and viruses were concentrated simultaneously and the nucleic acids were extracted concurrently. For detection of the nucleic acids, (RT-)rt-PCR methods were employed and the different procedures were compared through recovery efficiencies, which were determined by recovery rates. In this study, data about recovery rates were collected and improvements of efficiencies were contributed. Based on this, further researches and optimization of methods may follow.