Charakterisierung von Ethidiumbromid induzierten Läsionen im Rückenmark von Mäusen als Tiermodell für Rückenmarksverletzungen nach spontan auftretenden Bandscheibenvorfällen bei Hunden

Burigk, Laura

Dissertation 2023 CC BY-NC 4.0

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Charakterisierung von Ethidiumbromid induzierten Läsionen im Rückenmark von Mäusen als Tiermodell für Rückenmarksverletzungen nach spontan auftretenden Bandscheibenvorfällen bei Hunden

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Bandscheibenvorfälle stellen eine der häufigsten Ursachen für Rückenmarksverletzungen bei Hunden dar. Das Ausmaß der Verletzung ist abhängig vom primären Schaden durch das direkte Trauma sowie einer sekundären, protrahierenden Schädigung des Rückenmarks. Da eine signifikante Anzahl an Tieren durch diese Verletzungen erhebliche Einschränkungen im Alltag aufweist bzw. mit einer infausten Prognose euthanasiert wird, ist die Entwicklung neuer Therapiestrategien unerlässlich. Hierfür ist ein umfangreiches Wissen über die Pathogenese der Erkrankung sowie die Art der beteiligten Zellen notwendig.

Das Ziel der durchgeführten Untersuchungen war die Etablierung und Charakterisierung eines standardisierten Tiermodells in Mäusen für spontan auftretende Rückenmarksverletzungen bei Hunden nach Bandscheibenvorfall. Die Hypothese lautete, dass bei der Maus gleichartige morphologische und molekulare Veränderungen im Rückenmark nach Ethidiumbromid-induzierter Rückenmarksschädigung auftreten wie bei Hunden nach natürlich auftretendem Bandscheibenvorfall.

C57Bl6/6J Wildtyp Mäuse erhielten entweder eine stereotaktische, intraspinale Injektion mit Ethidiumbromid (EtBr) oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den Ventralstrang des Rückenmarks. Als Kontrollgruppe fungierten gleichaltrige Tiere ohne eine Operation. Die Tiere wurden regelmäßig klinisch untersucht und die Hinterhandfunktion mittels eines modifizierten Basso Mouse Scales beurteilt. Die Sektion und Probenentnahme wurden an Tag 3, 21, 63 bzw. 126 nach der Injektion durchgeführt. Die Untersuchung des Rückenmarks erfolgte an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem oder in O.C.T eingebettetem und bei -80°C tiefgefrorenem Rückenmarksgewebe aus dem Bereich der Injektion. Zum einen wurden 2-3µm dicke Rückenmarksquerschnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt sowie immunhistologisch mit Antikörpern gerichtet gegen APC (Oligodendrozyten), Aquaporin 4 (Wasserkanäle), β-APP (Axonschaden), CD3 (T-Lymphozyten), CD45R (B-Lymphozyten), CD107b (Mikroglia/Makrophagen), saurem Gliafaserprotein (Astrozyten), Iba1 (Mikroglia/Makrophagen), basischem Myelinprotein (Demyelinisierung), Nogo A (Oligodendrozyten), nicht-phosphorylierte Neurofilamente (Axonschaden) und Periaxin (Schwann-Zellen) untersucht. Darüber hinaus wurde eine RNS-Sequenzierung der Gesamt-RNS des Rückenmarks im Bereich der Injektionsstelle durchgeführt.

Die bei der Maus gewonnenen Daten wurden mit Daten hinsichtlich morphologischer und molekularer Veränderungen aus bereits publizierten Studien (SPITZBARTH et al. 2011; BOCK et al. 2013) an Hunden mit Rückenmarksverletzung nach spontanem Bandscheibenvorfall verglichen. Innerhalb dieser Studien wurden 17 Hunde unterschiedlicher Rassen mit klinisch diagnostiziertem Bandscheibenvorfall untersucht. Die Tiere wurden aufgrund des zeitlichen Abstands zwischen dem Auftreten erster neurologischer Ausfallerscheinungen und der Euthanasie in eine akute (1-4 Tage) und eine subakute (5-10 Tage) Gruppe eingeteilt (SPITZBARTH et al. 2011). Die traumatisierten Areale im Rückenmark der Tiere wurden nach der Euthanasie lichtmikroskopisch mittels Hämatoxylin Eosin, sowie immunhistologisch mittels phosphoryliertem Neurofilament, nicht-phosphoryliertem Neurofilament, β-Amyloid Vorläuferprotein, GAP-43 und basischem Myelinprotein untersucht. Des Weiteren erfolgte eine molekulare Analyse hinsichtlich der Expression von Matrix-Metalloproteinasen 2 und 9 mittels real-time qPCR (BOCK et al. 2013).

Über den Zeitverlauf zeigte sich bei den Mäusen nach EtBr Injektion ein früher und anhaltender Axonschaden, begleitet von einer durch Mikroglia/Makrophagen dominierten Entzündungsreaktion. Intraläsionale Demyelinisierung sowie eine signifikante Aktivierung von Astrozyten im periläsionalen Areal, fand sich ab Tag 21. Ab Tag 63 konnte eine beginnende Remyelinisierung durch Schwann-Zellen im Bereich der Läsion, unter gleichzeitigem Verlust von Oligodendrozyten festgestellt werden.

Auf molekularer Ebene zeigte sich eine Hochregulation von Genen hauptsächlich an den frühen Zeitpunkten nach der Injektion von EtBr, wobei pro-apoptotische (Caspase 1 und 12, baculoviral IAP repeat containing 3-Gen) sowie anti-apoptotische (TNFRSF1A associated via death domain-Gen) Gene auffielen. Des Weiteren konnte eine Hochregulation der Matrix-Metalloproteinasen 3 und 12 festgestellt werden, welche im Zusammenhang mit De- und Remyelinisierung stehen.

Zusammenfassend zeigten sich bei Mäusen und Hunden auf morphologischer Ebene gleichartige Veränderungen hinsichtlich Axonschaden, der Ausprägung sowie der zellulären Beteiligung an der Entzündung sowie der Demyelinisierung. Molekular fanden sich gleichartige Veränderungen hinsichtlich der Aufregulation von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Diese Erkenntnisse führen zu dem Schluss, dass eine Injektion von EtBr in den Ventralstrang des Rückenmarks von Mäusen vergleichbare Veränderungen auslöst wie nach natürlich auftretenden Rückenmarksverletzungen nach Bandscheibenvorfall beim Hund. Auf Grundlage dieser Ergebnisse eröffnen sich mitunter neue Möglichkeiten der Therapieentwicklung für Hunde nach einem Bandscheibenvorfall.

Intervertebral disc herniations (IVDH) represent one of the most common causes of spinal cord injury in dogs. The extent of the injury is carried by a primary damage from the direct trauma and a secondary, protracting damage. Since a substantial number of animals have significant limitations in everyday life due to these injuries or are euthanized with a poor prognosis, the development of new therapy strategies is essential. This requires extensive knowledge of the pathogenesis of the disease and the type of cells involved.

The aim of the present study was to establish and characterize a murine animal model for spinal cord injury of dogs following spontaneous IVDH. The hypothesis was that morphological and molecular changes in the murine spinal cord following ethidium bromide-induced spinal cord injury are similar to those in dogs after naturally occurring IVDH.

C57Bl6/6J wild type mice received a stereotaxic intraspinal injection of ethidium bromide (EtBr) or phosphate-buffered saline solution (PBS) into the ventral part of the spinal cord. Animals of the same age without operation served as control group. All animals underwent regular clinical examinations and hindlimb function was assessed using a modified Basso Mouse Scale. Necropsy and tissue sampling were performed at 3, 21, 63, and 126 days post injection. Spinal cord lesions were examined using formalin-fixed and paraffin-embedded or O.C.T-embedded spinal cord tissue frozen at -80°C from the area of injection. 2-3µm thick cross sections of the spinal cord including the injection site were stained with hematoxylin and eosin or immunohistochemically labeled with antibodies directed against APC (oligodendrocytes), aquaporin 4 (water channels), β-APP (axonal damage), CD3 (T-lymphocytes), CD45R (B-lymphocytes), CD107b (microglia/macrophages), glial fibrillary acidic protein (astrocytes), Iba1 (microglia/macrophages), myelin basic protein (MBP; demyelination), Nogo A (oligodendrocytes), non-phosphorylated neurofilaments (axonal damage), and Periaxin (Schwann cells) were examined. In addition, sequencing of total RNA of the spinal cord including the injection site was performed.

Data obtained from mice were compared with data from previously published studies in dogs with spinal cord injury after spontaneous IVDH (SPITZBARTH et al. 2011; BOCK et al. 2013). Within these studies 17 dogs of different breeds suffering from spinal cord injury following naturally occurring IVDH. Animals were divided into an acute (days 1-4) and an subacute (days 5-10) groups depending on the timespan between the occurrence of neurological signs and euthanasia (SPITZBARTH et al. 2011). The lesioned spinal cord was investigated by light microscopy using hematoxylin and eosin as well as immunohistochemistry targeting phosphorylated and non-phosphorylated neurofilaments, β-APP, GAB-43 and MBP. Furthermore, molecular analysis included a quantification of matrix-metalloproteinases 2 and 9 mRNA expression using real-time quantitative PCR (BOCK et al. 2013).

Spinal cords of examined mice showed an early and persistent axonal damage after EtBr injection, accompanied by a microglia/macrophage-dominated inflammatory response. Intralesional demyelination as well as significant activation of astrocytes in the perilesional area was found from day 21 onwards. From day 63 onwards, an incipient intralesional remyelination by Schwann cells, with concomitant loss of oligodendrocytes, was detected.

At the molecular level, an upregulation of pro-apoptotic (caspase 1 and 12, baculoviral IAP repeat containing 3 gene) and anti-apoptotic (TNFRSF1A associated via death domain gene) genes was evident mainly at the early time points after EtBr injection., with Furthermore, an upregulation of matrix metalloproteinases 3 and 12, which are associated with de- and remyelination, was detected.

Summarising the results, similar changes were found in mice and dogs regarding axonal damage, the extent as well as the cellular involvement of inflammatory cells and the extent of demyelination on the morphological level. On the molecular level, similar changes were found with respect to the upregulation of matrix metalloproteinases (MMPs). These findings lead to the conclusion that injection of EtBr into the ventral aspect of the murine spinal cord induces changes comparable to those observed after naturally occurring spinal cord injury following IVDH in dogs. Based on these results, new therapy strategies for dogs after IVDH could be developed.