Expression des Transmembranrezeptors TIRC7 auf caninen Lymphozyten und Monozyten bei entzündlichen, neurologischen Erkrankungen des Hundes

Löwe, Thea-Katharina

Dissertation 2023 CC BY-NC 4.0

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Expression des Transmembranrezeptors TIRC7 auf caninen Lymphozyten und Monozyten bei entzündlichen, neurologischen Erkrankungen des Hundes

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Die T cell immune response cDNA7 (TIRC7) oder auch T cell Immune regulator 1 (TCIRG1) stellt einen Transmembranrezeptor auf Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen, wie Mikrogliazellen dar und wurde bereits auf humanen, sowie Lymphozyten von Nagern entdeckt. Das Molekül befindet sich in intrazellulären Clathrin beschichteten Vesikeln und wird in aktivierten Immunzellen über die Vesikel an die Membran transportiert und nach extrazellulär verschoben. Das Protein ist ko‑lokalisiert mit dem Human Leukocyte Antigen-DR-Isotyp (HLA-DR) und dem Cytotoxic T-Lymphocyte-associated Protein 4 (CTLA-4) und übt eine hemmende Wirkung auf die T-Zellstimulation aus, wodurch eine immune Überreaktion abgewendet werden kann. In humanmedizinischen Studien konnte ein therapeutisch eingesetzter TIRC7 Antikörper (AK) bei Autoimmunerkrankungen und Transplantationsreaktionen bereits gute Ergebnisse erzielen. In der Tiermedizin gelten bei entzündlichen Immunerkrankungen, wie z.B. der Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis (SRMA) immer noch Glukokortikosteroide als Therapeutikum der Wahl, trotz vielfältiger Nebenwirkungen.

In der vorliegenden Studie sollte erstmalig die TIRC7 Expression auf caninen Immunzellen nachgewiesen werden. Zudem sollte das Expressionsverhalten bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen betrachtet werden.

Zum Nachweis des TIRC7 Moleküls wurden periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMCs) von gesunden Hunden, extraneural entzündlich erkrankten Hunden, Hunden mit Meningoenzephalitis unbekannten Ursprungs (MUO) oder Polyarthritis (PA), Hunden mit SRMA und Hunden mit SRMA unter Therapie vergleichend mit einem anti-TIRC7-AK gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Eine Doppelfärbung erfolgte mit Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8, CD21, CD11b und CD14. Zusätzlich wurden pathohistologische Gewebeschnitte von Milz und Lymphknoten eines gesunden Hundes und Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) von an MUO und SRMA erkrankten Hunden immunhistologisch nach der ABC-Methode (Avidin-Biotin-Komplex) mit dem anti-TIRC7-AK gefärbt und vergleichend betrachtet. In der Immunfluoreszenzfärbung wurde ZNS-Gewebe von einem an MUO erkrankten Hund mit einer Doppelfärbung mit dem anti-TIRC7-AK und CD3, CD20 und Iba1 gefärbt und im besonderen Hinblick auf die doppeltpositiven Zellen analysiert.

In unserer Studie konnten wir erstmalig das TIRC7 Protein auf caninen Lymphozyten, Monozyten und Mikrogliazellen nachweisen. Der intrazelluläre TIRC7 Nachweis zeigte sich sehr variabel in den PBMCs. Es konnte jedoch eine signifikant höhere TIRC7 mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) bei erkrankten Hunden, die an extraneuralen Entzündungen litten, im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe erkannt werden. Ebenso stellten sich die MFI-Werte der an SRMA erkrankten Hunde signifikant höher dar als bei den gesunden Beagle. Bei SRMA wurde eine verstärkte Th2 Immunantwort nachgewiesen, während die Pathogenese der MUO und PA vor allem Th1 vermittelt ist. Im direkten Vergleich der beiden Gruppen zeigten die an SRMA erkrankten Tiere eine signifikant höhere MFI der TIRC7 Expression im peripheren Blut als die Tiere, welche an MUO oder PA erkrankt waren. Wir konnten einen signifikanten Zusammenhang zwischen ansteigender MFI und ansteigendem Körpergewicht (KGW) registrieren, während das Geschlecht und das Alter keinen Einfluss auf die TIRC7 Expression zu haben scheinen. Die Gruppe der extraneural entzündlich erkrankten Hunde wies eine signifikant höhere MFI bei erhöhter Körperinnentemperatur (KT) auf. Durch histopathologische Untersuchungen konnten wir die Lokalisation von TIRC7 auf die Membran und/oder das Zytoplasma begrenzen. Die signifikant höheren MFI-Werte der TIRC7 Expression in den extraneural, entzündlich erkrankten Hunden, wie auch bei den Hunden mit SRMA im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe stimmen mit den Erkenntnissen der Humanmedizin überein und weisen auf eine Hochregulation des Proteins nach Stimulation der Immunzellen hin. Die signifikant niedrigeren MFI-Werte der TIRC7 Expression in der Gruppe der primär Th1 vermittelten Immunerkrankungen im Vergleich zu der Erkrankungsgruppe der SRMA können entweder eine stärkere Migration der TIRC7 positiven Immunzellen in das betroffene Gewebe bei Tieren mit MUO oder PA bedeuten oder der Einfluss der Th2 Immunantwort wird, wie auch in der Humanmedizin beschrieben, im peripheren Blut deutlich. Die signifikant steigenden MFI-Werte mit höherem KGW müssen vorsichtig betrachtet werden, könnten aber einen ersten Hinweis auf eine Beteiligung von TIRC7 an dem unterschwelligen Entzündungsprozess bei erhöhtem Fettgewebsanteil geben.

Weitere Studien zum Vorkommen von TIRC7 in der Veterinärmedizin, besonders im betroffenen Gewebe und im Hinblick auf die Verschiebung von intra- nach extrazellulär und den Zusammenhang mit Th17 Zellen sind aufgrund der erhaltenen Ergebnisse eine erstrebenswerte Folge. Der therapeutische Einsatz eines anti-TIRC7-AK bei Hunden mit immunvermittelten Erkrankungen, vergleichbar mit Studien der Humanmedizin, wären ein ggf. nachfolgender zweiter Schritt, um langfristig die Gabe einer panimmunsuppressiven Therapie abzulösen.

T cell immune response cDNA 7 (TIRC7) or T cell immune regulator 1 (TCIRG1) represents a transmembrane receptor on lymphocytes, monocytes and macrophages such as microglial cells and has been previously discovered in human and rodents. The molecule is located in intracellular clathrin-coated vesicles and is transported across the vesicles to the membrane in activated immune cells. The protein co-localizes with the Human Leukocyte Antigen-DR-Isotyp (HLA-DR) and the Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) and exerts an inhibitory effect on T-cell stimulation, averting immune overreaction. In human medical studies, a therapeutically used TIRC7 antibody (Ab) has already achieved good results in autoimmune diseases and transplantation reactions. In veterinary medicine, glucocorticosteroids are still considered the therapy of choice for inflammatory immune diseases, such as steroid-responsive meningitis-arteriitis (SRMA), despite multiple side effects.

In the present study, TIRC7 expression on canine immune cells should be detected for the first time. In addition, the expression behavior in different inflammatory diseases should be considered.

To detect the TIRC7 molecule, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy dogs, dogs with extraneural inflammatory diseases, dogs with meningoencephalitis of unknown origin (MUO) or polyarthritis (PA), dogs with SRMA, and dogs with SRMA under treatment were stained with an anti-TIRC7 Ab and comparatively examined by flow cytometry. Double staining was performed with Abs against CD3, CD4, CD8, CD21, CD11b and CD14. In addition, pathohistological tissue sections from spleen and lymph nodes from a healthy dog and central nervous system (CNS) tissues from dogs with MUO and SRMA were immunohistochemically stained using the ABC method (Avidin-Biotin Complex) with an anti-TIRC7 Ab and comparatively examined. In immunofluorescence staining, CNS tissue from a dog suffering from MUO was stained with the anti-TIRC7 Ab and Abs against CD3, CD20 and Iba1 and analysed with special emphasis to double positive cells.

Our study was the first to detect TIRC7 protein on canine lymphocytes, monocytes, and microglial cells. Intracellular TIRC7 detection was found to be highly variable in PBMCs. However, a significantly higher TIRC7 mean fluorescence intensity (MFI) was detected in dogs with extraneural inflammatory diseases compared with the healthy control group. Similarly, the MFI values of the SRMA-diseased dogs turned out to be significantly higher than those of the healthy beagles. In SRMA a mainly Th2-mediated immune response is described, whereas the pathogenesis of MUO and PA is primarily Th1-mediated. In a direct comparison of the two groups, animals suffering from SRMA showed significantly higher MFI of TIRC7 expression in peripheral blood than animals suffering from MUO or PA. We registered a significant correlation between increasing MFI and increasing body weight (BW), whereas sex and age did not seem to affect TIRC7 expression. The group of dogs with extraneural, inflammatory diseases showed significantly higher MFI, when the internal body temperature was elevated, in contrast to the other disease groups. Histopathological examination allowed us to limit the localization of TIRC7 to the membrane and/or cytoplasm. The significantly higher MFI values of TIRC7 expression in dogs with extraneural, inflammatory diseases, as well as in the dogs with SRMA compared to the healthy control group, are consistent with findings in human medicine and indicate upregulation of the protein with stimulation of the immune cells. The significantly lower MFI values of TIRC7 expression in the group of primarily Th1-mediated immune diseases compared with the disease group of SRMA may imply either a stronger migration of TIRC7-positive immune cells into the affected tissue in animals with MUO or PA or an influence of the Th2 immune response, as also described in human medicine. The significantly increasing MFI levels with higher BW have to be considered cautiously, but might give a first hint of an involvement of TIRC7 in the inflammatory process induced by adipose tissue.

Because of the described results further veterinary studies on the presence of TIRC7 in inflamed tissues, on the shift from intra- to extracellular compartment and on the potential relationship with Th17 cells, would be the consequence. The therapeutic use of an anti-TIRC7 Ab in canine immune-mediated diseases, comparable to studies in human medicine, would be a possible subsequent second step to replace the administration of panimmunosuppressive therapy in the long term.