Entwicklung eines innervierten 3D-Hautmodells zur Identifikation von hautsensibilisierenden Substanzen

In aktuellen Studien konnte gezeigt werden, dass die sensorischen Neurone der Haut in engem Kontakt zu Keratinozyten und anderen Hautzellen stehen und so eine wichtige Rolle in der Schmerzempfindung, bei Entzündungen und sensitivierenden Reaktionen in der Haut spielen. Da im Rahmen der REACH-Verordnung Chemikalien unter anderem auf ihre hautsensitivierenden Eigenschaften untersucht werden müssen, gibt es verschiedene In-vitro-, In-silico- sowie In-vivo-Methoden, um Substanzen zu identifizieren. Die bisher in der Literatur etablierten Methoden beziehen sich dabei hauptsächlich auf die Reaktion der Keratinozyten und dendritischen Zellen der Haut. Um auch die Beteiligung sensorischer Neurone in der Reaktion auf hautsensitivierende Substanzen in vitro beurteilen zu können, sollte in der vorliegenden Arbeit ein innerviertes Vollhautmodell aufgebaut werden, um das Einwachsen sensorischer Neuronen in die oberen Hautschichten abbilden zu können. Die darin verwendeten sensorischen Neurone und Schwann-Zellen wurden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert. Um den Erfolg der Differenzierung zu untersuchen, wurden die Zellen mittels RT-qPCR und immunzytochemischer Färbung charakterisiert. Im weiteren Verlauf des Projektes wurden die Neuronen in zwei verschiedene Vollhautmodelle integriert. Das erste Modell bestand aus einer Kollagenmatrix, welche nacheinander mit Fibroblasten, sensorischen Neuronen, Schwann-Zellen und Keratinozyten besiedelt wurde. In einem zweiten Modell wurden Fibroblasten in eine Hydrogelmatrix aus Fibrin und Matrigel eingebettet und auf ein 3D-gedrucktes Scaffold mit bereits darauf ausgesäten sensorischen Neuronen gegossen. Nach dem Aushärten wurden auf der Oberfläche Keratinozyten ausgesät. Aus der Kollagenmatrix wurden jeweils eine Hälfte als RT-qPCR-Proben verwendet und die andere Hälfte für Kryoschnitte eingefroren, welche später immunzytochemisch gefärbt wurden. Die Fibrinmodelle wurden vollständig fixiert und immunzytochemisch gefärbt, um das Neuritenwachstum mit einem Konfokalmikroskop zu untersuchen. Die aus den Stammzellen differenzierten Neurone wurden zusätzlich mit zwei verschiedenen Konzentrationen NGF (10 ng/mL und 100 ng/mL) behandelt und es konnte gezeigt werden, dass bereits in einer zweidimensionalen Monokultur ein Einfluss der NGF-Konzentration auf das Neuritenwachstum nachweisbar ist. Gleichzeitig wurden die primären Keratinozyten und HaCaTs im Vergleich mit DNCB, einer stark hautsensitivierenden Substanz, behandelt und mittels eines ELISA die NGF-Produktion der Zellen untersucht. Die NGF-Produktion war dabei vor allem bei HaCaTs zu sehen. Die dreidimensionalen Kollagen- und Fibrinmodelle haben in diesem Projekt keine Epidermis ausgeprägt und es konnte keine Innervation dargestellt werden. Entsprechend konnte das Neuritenwachstum nicht in Abhängigkeit von einer sensitivierenden Substanz dargestellt werden. Es müssten also zunächst die Modelle optimiert werden, zum Beispiel über die Verwendung einer dünneren Matrix bei den Kollagenmodellen und die Zugabe von Schwann-Zellen zu den Fibrinmodellen. Sofern die Innervation in den Modellen dann erfolgreich dargestellt werden kann, sollte es möglich sein, hautsensitivierende Substanzen anhand des Neuritenwachstums zu identifizieren.