Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Phenotypic characteristics of satellite glial cells of sensory ganglia with special reference to species-specific variations and commonalities

Dorsal root ganglia (DRG) represent sensory ganglia of the peripheral nervous system (PNS). They are located between two vertebral bodies in neural foramina where dorsal roots of the spinal nerves enter the spinal canal. Sensory ganglia harbour the cell bodies of sensory, pseudounipolar neurons. Their peripheral branch transmits somatosensory signals from the periphery to the neuronal body where information is processed and forwarded to the central nervous system (CNS) by the central branch of sensory neurons. Depending on their functional attribution, sensory neurons can be divided into subgroups including proprioceptive and mechanoreceptive “large-light” neurons (A-neurons) and “small-dark” neurons (C-neurons) predominantly relaying pain signals. Additionally, sensory ganglia contain myelinated and non-myelinated nerve fibres and Schwann cells, tissue-resident immune cells, small amounts of fibrous tissue, blood vessels and capillaries and their unique glial cell population, the so-called satellite glial cells (SGCs). Several SGCs tightly enwrap each neuronal soma creating an intimate anatomical and functional unit. SGCs are derived from neural crest stem cells (NCC) as are sensory neurons and Schwann cells of the PNS. SGCs are in charge of preserving, protecting and modulating neuronal environment similar to the functions of other glial cell populations of the CNS such as astrocytes. They fulfil their tasks by communicating with neurons via several transporters and channels, processing of neurotransmitters and by intercellular contact with each other via gap junctions. In response to injurious processes, SGCs have shown to react by alterations in their phenotype, proliferation, enhanced communication and influencing neuronal excitation. However, SGCS are not only associated with beneficial and protective traits, but also seem to be involved in the generation of pain and altered nociceptive behaviour of neurons. This made them interesting therapeutic targets for treatment of neuropathic pain. Furthermore, they have been attributed a neurogenic and/or regenerative, stem-cell like potential. Although, the knowledge of this special cell population has grown, most of it is gathered from studies in rodents including mice and rats and often mostly in the context of pathological conditions. Very few studies report about SGCs of humans and other species such as dogs and pigs. However, with respect to a translational approach, dogs and pigs represent ideal large animal models.    

This thesis comprises two parts based on the hypothesis that SGCs represent a potential source of regenerative capacity and might therefore constitute suitable candidates for future cell transplantation studies to enhance regeneration within the injured CNS and PNS. The first aim (1) was to establish and comparatively analyse a panel of markers in adult SGCs of DRG in physiological conditions in the species mouse, dog and pig. The focus was to assess species-specific variations and commonalities and to identify potential functional subgroups among SGCs. The second aim focused on (2) identifying alterations in murine SGCs in a murine model of the neurodegenerative lysosomal storage disease GM1-gangliosidosis with particular emphasis on changes that may indicate possible protective and regenerative properties of SGCs.

It was shown that glutamine synthetase (GS) and the inwardly rectifying potassium channel Kir 4.1 (Kir 4.1) are suitable to be used as specific markers for the detection of SGCs in DRG of mice, dogs and pigs. No other cells within DRG showed immunoreactivity for GS nor Kir 4.1, which made them ideal candidates for double labeling in immunohistochemistry/immunofluorescence to ensure obtained signal affiliation and reduce the risk of false-negative results. Species-specific discrepancies were found for the typical astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) as well as the oligodendrocyte marker 2′,3′-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase). While murine SGCs lacked expression of both, the majority of canine and porcine SGCs were immunopositive for GFAP and CNPase. A potential immune-cell like subtype of SGCs was detected in mice and pigs. A subgroup of murine SGCs displayed immunoreactivity for the common leukocyte marker CD45 and a small group of porcine SGCs was immunopositive for the macrophage marker Iba1. Canine SGCs did not reveal immunoreactivity for applied immune-cell markers. With respect to stem cell characteristics and potential regenerative properties of SGCs, a large subgroup of murine SGCs revealed immunoreactivity for the oligodendrocyte precursor marker neural/glial antigen 2 (NG2). Additionally, the majority of canine and porcine SGCs were immunopositive for the neural progenitor transcription factor Sox2, while none of murine SGCs were immunopositive for Sox2. This indicates that SGCs possess stem cell like features with potential regenerative properties. In porcine DRG, it was shown that the diameter of sensory neurons was similar to that of humans and that they were mainly composed of large sized neurons, followed by medium and small sized neurons. Additionally, a larger neuronal diameter was associated with a higher the number of surrounding SGCs. Moreover, porcine SGCs expressed the water channel AQP4, which is found in astrocytes in the CNS mainly. It appeared that AQP4-positive SGCs were mostly found around small and medium sized neurons, which are known to be mostly linked to nociception.

 

With the knowledge obtained from the results of the first part of this study, the second part focused on investigating potential phenotypic alterations in SGCs of homozygous knock-out mice in a murine model of GM1-gangliosidosis. With progression of disease, SGCs revealed an increased expression of GFAP at the age of 4 months, started to proliferate at the age 6 months and displayed immunoreactivity for the progenitor marker nestin at the age of 8 months. This altered expression profile indicates signs of activation as well as dedifferentiation in SGCs of Glb1-/- mice.

 

In summary, SGCS represent a unique and plastic glial cell population of the PNS. They possess phenotypic peculiarities with species-specific differences and similarities. Specifically canine and porcine SGCs share phenotypic characteristics with glial cells of the CNS. Furthermore, there seem to be functional subgroups among SGCs with immune-like properties and stem cell like features. Additionally, specific marker expression and function in SGCs could be related to the type of sensory neuron they surround. Interestingly, an altered expression profile of SGCs with signs of activation and dedifferentiation as a response to neurodegeneration in the course of GM1-gangliosidosis was observed. Altogether, the obtained knowledge of the phenotypic characteristics and peculiarities of SGCs in different species is prerequisite for future studies on this cell population, specifically for in vitro studies. Their stem cell characteristics and ability to adapt their phenotype in response to noxious impacts makes them exciting candidates for further research in different species.

Dorsalwurzelganglien (DWG) sind sensorische Ganglien des peripheren Nervensystems (PNS). Sie befinden sich zwischen zwei Wirbelkörpern in den Neuroforamina, in denen die Dorsalwurzeln der Spinalnerven in den Spinalkanal eintreten. Die sensorischen Ganglien beherbergen die Zellkörper von sensorischen, pseudounipolaren Neuronen. Ihr peripherer Nervenast leitet somatosensorische Signale aus der Peripherie an den Neuronenkörper, in dem die Informationen verarbeitet und durch einen zentralen Nervenast an das zentrale Nervensystem (ZNS) weitergeleitet werden. Je nach ihrer funktionellen Zuordnung können sensorische Neuronen in Untergruppen unterteilt werden, zu denen propriozeptive und mechanorezeptive, sogenannte "large-light"-Neurone (A-Neurone) und sogenannte "small-dark"-Neurone (C-Neuronen) gehören, die vorwiegend Schmerzsignale weiterleiten. Darüber hinaus enthalten sensorische Ganglien myelinisierte und nicht-myelinisierte Nervenfasern inklusiver der Schwannzellen, gewebeeigene Immunzellen, geringe Mengen an Bindegewebe, Blutgefäße und Kapillaren sowie eine spezielle Gliazellpopulation, die sogenannten Satellitengliazellen (SGZ). Jeder Neuronenkörper wird von mehreren SGZ eng umschlossen und dadurch bildet sich eine intime anatomische und funktionelle Einheit aus Neuronen und SGZ. SGZ sowie auch sensorische Neurone und Schwannzellen des PNS stammen von Neuralleisten-Stammzellen ab. SGZ tragen zur Stabilisierung der neuronalen Umgebung bei, indem sie sie schützen und modulieren, ähnlich den Aufgaben anderere Gliazellpopulationen wie z.B. der Astrozyten im ZNS. SGZ verfügen über verschiedene Transporter und Kanäle, über die sie mit den sensorischen Neuronen kommunizieren und Neurotransmitter verarbeiten. Außerdem stehen SGZ untereinander über gap junctions in interzellulärem Kontakt. Als Reaktion auf schädigende Prozesse reagieren SGZ nachweislich mit Veränderungen ihres Phänotyps, Proliferation, verstärkter Kommunikation und beeinflussen die neuronale Erregbarkeit. SGZ werden jedoch nicht nur mit positiven und schützenden Eigenschaften in Verbindung gebracht, sondern scheinen auch an der Entstehung von Schmerzen und einem veränderten nozizeptiven Verhalten von Neuronen beteiligt zu sein. Dies macht sie zu interessanten therapeutischen Zielen für die Behandlung von neuropathischen Schmerzen. Außerdem wird ihnen ein neurogenes und/oder regeneratives, stammzellähnliches Potenzial zugeschrieben. Obwohl das Wissen über diese spezielle Zellpopulation gewachsen ist, stammen die meisten Erkenntnisse aus Studien, die Mäuse und Ratten als Versuchstiere nutzen. Außerdem liegt der Fokus dieser Studien häufig auf die Gegebenheiten im Rahmen pathologischer Zustände z.B. nach peripherem Nervenschaden. Nur sehr wenige Studien berichten über SGZ bei Menschen und anderen Tierarten wie Hunden und Schweinen. Im Hinblick auf einen translationalen Ansatz stellen Hunde und Schweine jedoch ideale Großtiermodelle dar.

Die vorliegende Arbeit besteht aus zwei Teilen, die auf der Hypothese beruhen, dass SGZ regeneratives Potenzial besitzen und daher geeignete Kandidaten für zukünftige Zelltransplantationsstudien zur Verbesserung der Regeneration im geschädigten ZNS und PNS darstellen könnten. Das erste Ziel (1) bestand darin, bei den Tierarten Maus, Hund und Schwein ein Panel von Markern in adulten SGZ von DWG im physiologischen Zustand zu etablieren und vergleichend zu analysieren. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Untersuchung tierartspezifischer Unterschiede und Gemeinsamkeiten sowie auf der Erforschung potenzieller funktioneller Untergruppen innerhalb der SGZ-Population. Das zweite Ziel (2) konzentrierte sich auf potenzielle Veränderungen in murinen SGZ in einem Mausmodell der neurodegenerativen lysosomalen Speicherkrankheit GM1-Gangliosidose mit besonderem Schwerpunkt auf Veränderungen, die auf mögliche schützende und regenerative Eigenschaften von SGZ hinweisen könnten.

Es wurde gezeigt, dass Glutaminsynthetase (GS) und der einwärtsgerichtete Kaliumkanal Kir 4.1 (Kir 4.1) als spezifische Marker für den Nachweis von SGZ im DWG von Mäusen, Hunden und Schweinen geeignet sind. Keine anderen Zellen im DWG zeigten Immunreaktivität für GS oder Kir 4.1. Daher eigen sich diese besonders für Doppelmarkierungen in der Immunhistochemie/Immunfluoreszenz, um das Risiko falsch-negativer Ergebnisse zu verringern und Zellen eindeutig zuordnen zu können. Spezies-spezifische Diskrepanzen wurden für den typischen Astrozyten-Marker saures Gliafaserprotein (GFAP) sowie für den Oligodendrozyten-Marker 2′,3′-zyklisches-Nukleotid 3'-phosphodiesterase (CNPase) festgestellt. Während SGZ von Mäusen weder GFAP noch CNPase exprimierten, zeigte die Mehrheit der SGZ von Hunden und Schweinen positive Immunreaktionen für GFAP und CNPase. Bei Mäusen und Schweinen wurde ein potenzieller immunzellähnlicher Subtyp von SGZ nachgewiesen. Eine Untergruppe der SGZ von Mäusen zeigte Immunreaktivität für den gemeinsamen Leukozytenmarker CD45 und eine kleine Gruppe von SGZ von Schweinen war immunopositiv für den Makrophagenmarker Iba1. SGZ von Hunden zeigten keine Immunreaktivität für die verwendeten Immunzellmarker. Im Hinblick auf die Stammzellcharakteristika und die potenziellen regenerativen Eigenschaften der SGZ zeigte eine große Untergruppe der SGZ der Maus Immunreaktivität für den Oligodendrozyten-Vorläufer-Marker Neural/Glial Antigen 2 (NG2). Darüber hinaus war die Mehrheit der SGZ von Hunden und Schweinen immunopositiv für den neuralen Vorläufer-Transkriptionsfaktor Sox2, während keine der SGZ von Mäusen immunopositiv für Sox2 waren. Dies deutet darauf hin, dass SGZ stammzellähnliche Merkmale mit potenziell regenerativen Eigenschaften besitzen.  In den DWG der Schweine stellte sich heraus, dass der Durchmesser der sensorischen Neurone dem des Menschen ähnlich ist und dass sie hauptsächlich aus großen Neuronen bestehen, gefolgt von mittelgroßen und kleinen Neuronen. Darüber hinaus fand sich eine Korrelation zwischen Größe des Neurons und Anzahl der umgebenden SGZ. Je größer das Neuron, desto mehr SGZ umschlossen es. Außerdem exprimierten die SGZ von Schweinen den Wasserkanal AQP4, der vor allem in Astrozyten im ZNS vorkommt. Es zeigte sich, dass AQP4-positive SGZ vor allem in der Umgebung von kleinen und mittelgroßen Neuronen zu finden waren, von denen bekannt ist, dass sie hauptsächlich mit der Nozizeption in Verbindung stehen.

Auf Basis der Erkenntnisse aus dem ersten Teil dieser Studie konzentrierte sich der zweite Teil auf die Untersuchung möglicher phänotypischer Veränderungen in SGZ von homozygoten knock-out-(Glb1-/-) Mäusen in einem Mausmodell der GM1-Gangliosidose. Mit Fortschreiten der Krankheit zeigten SGZ im Alter von 4 Monaten eine erhöhte GFAP-Expression, begannen im Alter von 6 Monaten zu proliferieren und zeigten im Alter von 8 Monaten Immunreaktivität für den Progenitor-Marker Nestin. Das veränderte Expressionsprofil der SGZ von Glb1-/- Mäusen deutet darauf hin, dass SGZ im Rahmen der Erkrankung aktiviert werden und Anzeichen von Dedifferenzierung zeigen.

 

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SGZ eine einzigartige und plastische Gliazellpopulation des PNS darstellen. Sie weisen phänotypische Besonderheiten mit artspezifischen Unterschieden und Ähnlichkeiten auf. Insbesondere der Phänotyp der SGZ von Hund und Schwein ähnelt dem von Gliazellen des ZNS. Darüber hinaus scheint es unter den SGZ funktionelle Untergruppen mit immunähnlichen Eigenschaften und stammzellähnlichen Merkmalen zu geben. Außerdem könnten die Expression spezifischer Marker und die Funktion von SGZ davon abhängen, welchen Typ an sensorischen Neuronen sie umgeben. Interessanterweise wurde ein verändertes Expressionsprofil von SGZ mit Anzeichen von Aktivierung und Dedifferenzierung als Reaktion auf die Neurodegeneration im Verlauf der GM1-Gangliosidose beobachtet. Insgesamt ist das gewonnene Wissen über die phänotypischen Merkmale und Besonderheiten von SGZ in verschiedenen Spezies Voraussetzung für künftige insbesondere in-vitro-Studien mit dieser Zellpopulation. Ihre Stammzelleneigenschaften und ihre Fähigkeit, ihren Phänotyp als Reaktion auf schädliche Einflüsse anzupassen, machen sie zu interessanten Kandidaten für weitere Forschungen in verschiedenen Tierarten.

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