Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Transfer equiner Oozyten und früher ICSI-Embryonen durch Punktion in den periovulatorischen Follikel (Intrafollikulärer Oozytentransfer - IFOT, Intrafollikulärer Embryonentransfer - IFET) im Vergleich zum hysteroskopisch-geleiteten Transfer in den Eileiter (Ovidukt Oozytentransfer - OOT, Ovidukt Embryonentransfer - OET) zur Generierung transfertauglicher Blastozysten bei der Stute

Die Möglichkeit durch einen Eingriff zur Eizellgewinnung bei der Stute multiple transfertaugliche Embryonen zu generieren, ist für Züchter reizvoll. Nach wie vor stellt die In-vitro-Kultivierung von Embryonen, erzeugt durch intrazytoplasmatische Spermieninjektion in eine Eizelle, eine der größten Hürden in dem Prozess dar. In der vorliegenden Arbeit wurden Verfahren entwickelt, um die geringe Effizienz der In-vitro-Kultivierung von befruchteten Eizellen durch eine temporäre In-vivo-Kultivierung und -Reifung zu ersetzen. Hierzu sollte ein schonendes Transferverfahren in den Follikel und, um die bisherigen chirurgischen Methoden mit Eröffnung der Bauchhöhle abzulösen, ein Verfahren mit hysteroskopisch-geleitetem Zugang zum Eileiter entwickelt werden.

Die genutzten Eizellen wurden aus Schlachthofovarien oder durch Ovum Pick-Up gewonnen. Die Durchführung erfolgte in vier Versuchsreihen: Intrafollikulärer Oozytentransfer (IFOT, Stute 1, 2 und 3), Intrafollikulärer Embryonentransfer (IFET, Stute 4, 5 und 6), Ovidukt Oozytentransfer (OOT, Stute 1, 2 und 3) und Ovidukt Embryonentransfer (OET, Stute 4, 5 und 6). Insgesamt wurden 73 (5/11/25/32) Eizellen in vier IFOT-Versuchen und 22 (1/6/2/7/6) frühe Embryonalstadien in fünf IFET-Versuchen in den Follikel übertragen. Hysteroskopisch wurden 59 (16/11/16/17) gereifte Eizellen in vier OOT-Versuchen und 11 (4/4/3) frühe Embryonalstadien in drei OET-Versuchen in den Eileiter transferiert.

Der Transfer in den Eileiter erfolgte minimalinvasiv hysteroskopisch retrograd über die Eileiterpapille. Der Zugang zum Eileiter ist kompliziert, wurde jedoch in dieser Studie mit Hilfe eines modifizierten, aus der Eileiterhydrotubation etablierten Kathetersystem erfolgreich umgesetzt. Der gelungene Transfer, bewertet durch den Erhalt der Vitalität der Eizellen, wurde in Vorversuchen an Schlachtpräparaten mit einer Calcein-AM Färbung bewiesen. Für den intrafollikulären Transfer wurde ein modifiziertes transvaginales ultraschallgeleitetes Aspirations-System entwickelt.

Bei keiner der Stuten wurde nach dem Transfer eine Störung des klinischen Allgemeinbefindens festgestellt. Bei 81,25 % (13/16) fand nach den Eingriffen eine Ovulation statt. Versuche bei denen ein intrafollikulärer Transfer durchgeführt wurde (IFOT und IFET) dauerten durchschnittlich 27,82 min (10 - 60 min). Die hysteroskopischen Versuche (OOT und OET) dauerten durchschnittlich 59,38 min (25 - 90 min). Insgesamt wurden vier von insgesamt 16 Versuchen wiederholt. Ursächlich waren: ein Ovarhämatom, zwei anovulatorische hämorrhagische Follikel und eine besamungs-induzierte Endometritis.

469 (81 %) Eizellen wurden in-vitro maturiert und nach 26,04 Stunden (25 h - 29 h) auf die Extrusion eines Polkörpers überprüft. Daraus ergab sich eine Maturationsrate von 32,84 % (25,93 % - 100 %). Die Maturationsrate der Eizellen, die aus einem OPU-Vorgang stammten, lag bei 70,59 %. Die des Schlachthofmaterials betrug 31,42 %. Im Rahmen der IFOT-Versuchsreihe wurden 73 (5/11/25/32) Eizellen direkt nach der Gewinnung eingesetzt. Für den OOT wurden nach der In-vitro-Maturation 59 (15/11/16/17) gereifte Eizellen in die Eileiter transferiert. Nach der Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion für die Versuchsreihen IFET und OET wurde eine Teilungsrate von 45,05 % (0 % - 66,67 %) erreicht. Im Anschluss an die Versuche wurde 9,15 (7,5 – 11) Tage nach dem Transfer eine Embryospülung durchgeführt: In der IFOT-Versuchsreihe konnten vier unbefruchtete Eizellen gewonnen werden. Aus dem Ovidukt Oozytentransfer resultierten insgesamt drei Embryonen von drei Stuten. Die genetische Analyse ergab, dass die gewonnenen Embryonen/Eizellen nicht von den Eizellspendern stammten. Aus den Versuchsreihen IFET und OET konnten keine Embryonen zurückgewonnen werden.

In dieser Studie wurden minimalinvasive Transfermethoden zur Übertragung von Eizellen und frühen Embryonalstadien von Spenderstuten in den Follikel oder den Eileiter von Trägerstuten etabliert. Von den Spendertieren stammende Blastozysten konnten jedoch durch anschließende Uterusspülungen der Trägerstuten nicht generiert werden. Die Ursachen dafür gilt es durch weitere Forschung zu ergründen.

The opportunity of generating multiple embryos capable for transfer through one oocyte retrieval procedure in the mare is appealing to breeders. Still, in vitro cultivation of embryos, generated by intracytoplasmic sperm injection is one of the major hurdles in the process. In the present work, methods were developed to replace the low efficiency of in vitro cultivation of fertilized oocytes with temporary in vivo cultivation and maturation. For this purpose, a gentle transfer procedure into the follicle and a procedure with hysteroscopic-guided access to the fallopian tube were to be developed to replace the previous surgical methods with opening of the abdominal cavity.

The oocytes used were obtained from abattoir ovaries or by ovum pick-up. The procedure was performed in four experimental series, namely Intrafollicular Oocyte Transfer (IFOT, mare 1, 2 and 3), Intrafollicular Embryo Transfer (IFET, mare 4, 5 and 6), Oviduct Oocyte Transfer (OOT, mare 1, 2 and 3) and Oviduct Embryo Transfer (OET, mare 4, 5 and 6). A total of 73 (5/11/25/32) oocytes were transferred into the follicle in four sessions (IFOT) and 22 (1/6/2/7/6) early embryonic stages in five attempts (IFET). Hysteroscopically, 59 (16/11/16/17) matured oocytes (four sessions-OOT) and 11 (4/4/3) early embryonic stages (three sessions-OET) were transferred into the fallopian tube.

Transfer to the fallopian tube was performed minimally invasive retrograde via the uterine papilla by hysteroscopy. Access to the fallopian tube is complicated but was successfully implemented in this study using a modified catheter system established from tubal hydrotubation. Successful transfer, evaluated by preservation of oocyte viability, was demonstrated in preliminary experiments on abattoir specimens using Calcein-AM staining. A transvaginal ultrasound-guided aspiration system was modified for intrafollicular transfer.

No complications were observed in any of the mares after transfer. Ovulation occurred in 81.25 % (13/16) after the procedures. Trials in which intrafollicular transfer was performed (IFOT and IFET) lasted an average of 27.82 min (10 - 60 min). Hysteroscopy sessions (OOT and OET) lasted an average of 59.38 min (25 - 90 min). A total of four out of 16 attempts were repeated. This was caused by one ovarian hematoma, two anovulatory haemorrhagic follicles and one insemination-induced endometritis.

469 (81 %) oocytes were matured in vitro and checked for extrusion of a polar body after 26.04 h (25 h - 29 h). This resulted in a maturation rate of 32.84% (25.93% - 100%). The maturation rate of oocytes derived from an OPU procedure was 70.59 %. That of the slaughterhouse material was 31.42 %. In the IFOT experimental series, 73 (5/11/25/32) oocytes were used immediately after collection. For OOT, 59 (15/11/16/17) matured oocytes were transferred into the fallopian tubes after in vitro maturation.  After intracytoplasmic sperm injection for the IFET and OET experiments, a cleavage rate of 45.05 % (0 % - 66.67 %) was achieved. Following the experiments, embryo flushing was performed 9.15 (7.5 - 11) days after transfer: Four unfertilized oocytes were recovered in the IFOT experimental series. Oviduct oocyte transfer resulted in a total of three embryos from three mares. Genetic analysis revealed that the embryos/oocytes obtained were not from the oocyte donors. No embryos were recovered from the IFET and OET experimental series.

In this study, minimally invasive transfer methods were established to transfer oocytes and early embryonic stages from donor mares into the follicle or oviduct of carrier mares. However, blastocysts derived from the donor animals could not be generated by subsequent uterine flushes of the carrier mares. The reasons for this need to be elucidated by further research.

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