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Analyse der therapeutischen Effekte humaner mesenchymaler Stromazellen (MSC) bei Komplikationen des Diabetes mellitus mit Fokus auf chronische Wundheilungsstörungen

The development of chronic wounds is a serious complication of diabetes and their treatment is protracted and requires new effective methods. Human mesenchymal stromal cells (MSC), which possess immunomodulatory properties, pro-angiogenic properties, self-renewal ability and multipotent differentiation capacity, have been successfully applied for the treatment of chronic wounds (Falanga et al. 2007) (Hu et al. 2018).

This study investigated whether pooled human bone marrow-derived hMSC isolated and expanded in pooled pathogen-inactivated human platelet lysate (hPL) and treated with a high dose of gamma irradiation for pathogen reduction (MultiPL'100i) can promote wound healing in diabetic rats.

Using 8mm biopsy punches, 2 wounds were placed on the back of Zucker diabetic fatty rats. hMSC were applied to the wounds in a commercial fibrin glue at a concentration of 106 cells/cm2. The therapeutic effect of MSC was evaluated in comparison to untreated wounds and wounds treated with the fibrin glue alone. For this purpose, wound size was documented over 14 days and ultimately samples were collected and prepared for histological examination and gene expression analysis and studies by digital PCR. In addition, the influence of the treatments on the leukocyte count in the peripheral blood was analyzed and the presence of human DNA in the rats was tested.

Thanks to pilot studies, numerous suggestions to optimise the therapeutic potential of MSC were obtained. The first finding was the confirmation that MSC accelerated wound healing. Cryopreserved MSC seem to be less efficient, but cryodamage could be reversed by culturing MSC in a rescue culture for a few days before application to the wound. MSC showed therapeutic potential in haemostasis as well as in the inflammatory and proliferative phases of wound healing, and repeated application to the wound improved wound healing compared with a single application. With respect to the heterogeneity of the individual MSC donors, the MSC pool of 6 different MSC donors provided a homogeneous and wound healing efficient product that was equal or exceeded the performance of the individual donors in all parameters investigated. The interaction of human MSC with the rat's own immune cells was demonstrated, and the resolution of the chronic wound problem seemed to be partly achieved via macrophage polarisation towards anti-inflammatory M2 macrophage differentiation. MSC applications improved collagen formation in wounds presumably by increasing fibroblast function. We also confirmed the positive effect of MSC on angiogenesis.

In the biodistribution study, it was demonstrated that topically applied MSC were transported to other immunological organs such as the liver, spleen and lungs, presumably to be metabolised there. These findings were extremely important to evaluate the potential side effects and safety of such cell application. In our 14-day observation period, we did not observe any immune intolerance after xenogeneic MSC transplantation.

In summary, this work provided scientific evidence for a standardized, scalable and, most importantly, therapeutically effective pooled hMSC product. Pooled hMSC can accelerate dermal wound healing in diabetic rats by improving vascularization and dynamically recruiting M2-like macrophages. This study is the precursor to obtaining a manufacturing license for an advanced therapy medicinal product (ATMP) for clinical use in human patients.

Die Entstehung von schwer heilenden Wunden ist eine befürchtete Komplikation von Diabetes und ihre Behandlung ist langwierig und benötigt neue effektive Methoden. Humane mesenchymale Stromazellen (MSC), die über immunmodulatorische und pro-angiogene Eigenschaften, Fähigkeit zur Selbsterneuerung und über multipotente Ausdifferenzierungskapazitäten verfügen, wurden bereits erfolgreich für die Behandlung chronischer Wunden angewendet (Falanga et al. 2007) (Hu et al. 2018).

In dieser Studie wurde untersucht, ob gepoolte hMSC aus menschlichem Knochenmark, die in gepooltem pathogeninaktivierten humanen Thrombozytenlysat (hPL) isoliert und expandiert wurden und mit einer hohen Dosis Gammabestrahlung zur Pathogenreduktion (MultiPL'100i) behandelt wurden, die Wundheilung bei diabetischen Ratten fördern können.

Mittels 8mm-Biopsiestanzen wurden 2 Wunden auf dem Rücken von Zucker diabetic fatty Ratten gesetzt. hMSC wurden in einem kommerziellen Fibrinkleber in einer Konzentration von 106 Zellen/cm2 auf die Wunden appliziert. Die therapeutische Wirkung der MSC wurde im Vergleich zu unbehandelten und mit dem Fibrinkleber nach Opferung der Tiere die Wunden untersucht. Dafür wurden die Wundgrößen über 14 Tage dokumentiert und letztendlich Proben gesammelt, die zum einen histologisch untersucht wurden und zum anderen zur Genexpressionsanalyse und Untersuchungen mittels digitaler PCR dienten. Außerdem wurde der Einfluss der Behandlungen auf die Leukozytenzahl im peripheren Blut analysiert und das Vorhandensein menschlicher DNA in den Ratten geprüft.

Dank Pilotstudien wurden zahlreiche Hinweise zur Optimierung des therapeutischen Potenzials von MSC gewonnen. Die erste Erkenntnis war die Bestätigung, dass MSC die Wundheilung beschleunigten. Kryokonservierte MSC waren insgesamt weniger effizient, aber Kryoschäden konnten aufgehoben werden, indem MSC, vor ihrer Applikation auf die Wunde, für ein paar Tage in einer Rescue-Kultur aufgenommen wurden. Die MSC konnten ihr therapeutisches Potential sowohl in der Hämostase, als auch in den entzündlichen und proliferativen Phasen der Wundheilung entfalten und eine wiederholte Applikation auf die Wunde verbesserte die Wundheilung im Vergleich zu einer einmaligen Anwendung. In Bezug auf die Heterogenität der einzelnen MSC-Spendern erwies sich der MSC-Pool aus 6 verschiedenen MSC-Spendern als homogenes und wundheilungseffizientes Produkt, das in allen untersuchten Parametern der Leistung der Einzelspender gleichgestellt war oder diese übertraf. Die Interaktion der menschlichen MSC mit den Immunzellen der Ratten konnte nachgewiesen werden. Die Auflösung des chronischen Wundproblems schien teilweise über die Makrophagenpolarisierung in Richtung antiinflammatorischer M2-Makrophagen Ausdifferenzierung zu gehen. MSC-Applikationen förderten die Kollagenbildung in den Wunden, vermutlich indem sie die Leistung der Fibroblasten erhöhten. Auch eine positive Wirkung der MSC auf die Angiogenese konnten wir bestätigen.

Mittels einer Biodistributionsstudie wurde nachgewiesen, dass die topisch applizierten MSC in andere immunologische Organe wie die Leber, Milz und Lunge abtransportiert werden, vermutlich um dort abgebaut zu werden. Diese Erkenntnisse sind äußerst wichtig, um die möglichen Nebenwirkungen und die Sicherheit einer solchen Zellapplikation zu evaluieren. In dem 14-tägigen Beobachtungszeitraum wurde keine Immunintoleranz nach xenogener MSC-Transplantation beobachtet.

Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wissenschaftliche Beweise für ein standardisiertes, skalierbares und vor allem therapeutisch effektives gepooltes hMSC-Produkt erbracht. Gepoolte hMSC können die dermale Wundheilung diabetischer Ratten beschleunigen, indem sie die Vaskularisierung verbessern und dynamisch M2-ähnliche Makrophagen rekrutieren. Diese Studie ist die Vorstufe zur Erlangung einer Herstellungslizenz für ein Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP) für den klinischen Einsatz an menschlichen Patienten.

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