Pulmonary Defense Responses in Morbilliviral Diseases : Insights from Natural and Ex Vivo Canine Distemper Virus Infection
Numerous viruses target the respiratory tract and cause pulmonary damage, leading to respiratory distress. Effective antiviral defense strategies are essential to minimize virus-induced destruction, however, dysregulated immune responses may result in disease exacerbation and clinical complications. Canine distemper virus (CDV), a morbillivirus within the Paramyxoviridae family and closely related to measles virus (MeV), represents an important infectious agent in domestic and wild carnivores. In contrast to MeV, CDV affects a broad spectrum of hosts, including endangered wildlife species. Following aerosol-mediated transmission, virus infection results in systemic disease with respiratory and/or neurological dysfunction and severe, generalized immunosuppression. Despite the availability of effective vaccines, large CDV outbreaks continue to occur, especially in wildlife populations. Pulmonary CDV infection manifests as interstitial pneumonia with necrotizing bronchiolitis. Due to its central role as an interface between the host and environment, the respiratory tract represents an important organ system for studying morbillivirus pathogenesis and antiviral defense responses. The need of research to elucidate host-virus interactions is further substantiated by the fact that CDV has come into focus as a treatment option in neoplastic diseases (viral oncolysis). The present thesis includes two studies focused on pulmonary defense responses during CDV infection. In the first part, inflammatory changes, viral loads and immune responses were investigated in lung tissue of naturally CDV-infected dogs. Temporospatial phenotyping of immune cells by immunohistochemistry revealed increased numbers of MHC-II+, Iba-1+ and CD204+ innate immune cells during the acute and subacute phase of infection, which coincided with highest viral loads and inflammatory changes. CD3+ T cell numbers were elevated in the lung upon infection, but high CDV loads and decreased levels of interleukin (IL)-2 indicate a functional impairment during the acute phase of infection. B cells initially declined upon infection and showed repopulation in the lung during the subacute-chronic phase. Global transcriptome-based next generation sequencing (RNA-Seq) and RT-qPCR analysis of lung tissue from acutely CDV-infected dogs revealed increased levels of pro-inflammatory cytokine transcripts, such as tumor necrosis factor-α, IL-6 and IL-12. Simultaneously, genes associated with ciliary function and epithelial regeneration (e.g. HOATZ, DNAI3, GDF5) were downregulated in CDV-infected lungs. Moreover, RNA-Seq data indicate an activation of apoptotic processes and type I interferon responses. These findings were substantiated by immunohistochemical quantification of cleaved caspase-3 and type I interferon-related proteins (Mx protein, protein kinase R, interferon-stimulated gene 15). Pro-inflammatory pulmonary immune responses and reduced mucociliary clearance during acute CDV infection potentially contribute to both viral clearance and immune-mediated tissue damage in affected dogs. The second part of the thesis focused on early local pulmonary defense responses following ex vivo infection of canine precision-cut lung slices (PCLSs) with CDV (strain R252). Changes in viral burdens, ciliary beating activity, antigen-presenting capacities, and cytokine responses, were analysed during a cultivation period of six days. Moreover, cell tropism was investigated by immunohistochemistry, in situ hybridization, double immunofluorescence and transmission electron microscopy. Viability and ciliary beating activity were monitored by lactate dehydrogenase assay and light microscopy, respectively. Results indicate a progressive infection of both epithelial and myeloid cells. Most CDV-infected cells were located within the bronchial subepithelial tissue. Despite of an unchanged viability when compared to non-infected controls, a reduction of ciliary beating activity was detected in CDV-infected PCLSs, indicative of a functional impairment of mucociliary clearance. At day three postinfection, elevated levels of MHC-II+ cells were observed within the bronchial epithelium of CDV-infected PCLSs. Cytokine expression analysis via RT-qPCR revealed an upregulation of IL-10 and transforming growth factor-β at day one postinfection. Overall, data suggest that CDV replicates progressively in PCLSs, leading to anti-inflammatory cytokine responses and disturbed ciliary function.
In conclusion, the thesis describes pulmonary defense responses during CDV infection in dogs and PCLSs, providing new insights into the pathogenesis of canine distemper at different phases of infection. Infection of PCLSs allows targeting of the initial phase of infection, whereas the lungs of CDV-infected dogs with clinical disease show immune and inflammatory responses at different stages of manifest CDV infection. These dynamic changes in the course of infection must be considered in the development and application of immunotherapeutic intervention strategies in canine distemper.
Zahlreiche Viren greifen die Atemwege an und schädigen die Lunge, was zu Atemnot führt. Wirksame antivirale Abwehrstrategien sind unerlässlich, um die virusbedingte Zerstörung zu minimieren. Dysregulierte Immunreaktionen können jedoch zu einer Krankheitsexazerbation und klinischen Komplikationen führen. Das Hundestaupevirus (CDV), ein Morbillivirus aus der Familie der Paramyxoviridae, ist nah verwandt mit dem Masernvirus (MeV) und ein bedeutsamer Infektionserreger bei Haus- und Wildtieren. Im Gegensatz zum MeV befällt CDV ein breites Spektrum von Wirtsspezies, darunter auch gefährdete Wildtierarten. Nach einer aerosolvermittelten Übertragung führt die Virusinfektion zu einer systemischen Erkrankung mit respiratorischen und/oder neurologischen Funktionsstörungen und einer schweren, generalisierten Immunsuppression. Obwohl wirksame Impfstoffe zur Verfügung stehen, kommt es immer wieder zu großen CDV-Ausbrüchen, insbesondere in Wildtierpopulationen. Die pulmonale CDV-Infektion äußert sich als interstitielle Pneumonie mit nekrotisierender Bronchiolitis. Aufgrund seiner zentralen Rolle als Schnittstelle zwischen Wirt und Umwelt stellt der Respirationstrakt ein wichtiges Organsystem zur Untersuchung der Pathogenese von Morbilliviren und der antiviralen Abwehrreaktionen dar. Die Notwendigkeit der Erforschung von Wirt-Virus-Interaktionen wird auch durch die Tatsache untermauert, dass CDV als Behandlungsoption bei neoplastischen Erkrankungen in den Fokus gerückt ist Die vorliegende Arbeit umfasst zwei Studien, die sich auf die pulmonale Abwehrreaktion während einer CDV-Infektion fokussieren. Im ersten Teil wurden entzündliche Veränderungen, die Viruslast und die Immunreaktion im Lungengewebe von natürlich Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die frühen lokalen Abwehrreaktionen in der Lunge im Rahmen einer Ex-vivo-Infektion von kaninen Präzisions-Lungenschnitten (PCLSs) mit dem CDV-Stamm R252. Während einer Kultivierungsdauer von sechs Tagen wurden Veränderungen der Viruslast, der ziliären Aktivität, der Antigenpräsentationskapazität und der Zytokinantwort analysiert. Darüber hinaus wurde der Zelltropismus mittels Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung, Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung und Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Die Viabilität und ziliäre Aktivität wurden mittels eines Laktatdehydrogenase-Assays bzw. Lichtmikroskopie geprüft. Die Ergebnisse deuten auf eine progressive Infektion sowohl von Epithelzellen als auch von myeloischen Zellen hin. Die meisten CDV-infizierten Zellen wurden im subepithelialen Gewebe der Bronchien registriert. Trotz einer unveränderten Viabilität im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen wurde in CDV-infizierten PCLSs eine Verringerung der ziliären Aktivität festgestellt, was auf eine mögliche funktionelle Einschränkung der mukoziliären Clearance hinweist. Am dritten Tag nach der Infektion wurden im Bronchialepithel von CDV-infizierten PCLSs vermehrt MHC-II+-Zellen beobachtet. Die Analyse der Zytokinexpression mittels RT-qPCR ergab eine Aufregulation von IL-10 und dem Transformierenden Wachstumsfaktor-β am ersten Tag nach der Infektion. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass CDV in PCLSs repliziert, anti-inflammatorische Zytokinreaktionen in der Lunge induziert und die Zilienfunktion stört. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit die pulmonale Abwehrreaktion während einer CDV-Infektion bei Hunden und PCLSs beschrieben, was neue Einblicke in die Pathogenese der Hundestaupe in verschiedenen Phasen der Infektion ermöglicht. Die Infektion von PCLSs ermöglicht die gezielte Untersuchung der initialen Infektionsphase, während die Lungen CDV-infizierter Hunde mit klinischer Erkrankung Immun- und Entzündungsreaktionen in verschiedenen Phasen der manifesten CDV-Infektion zeigen. Diese dynamischen Veränderungen im Infektionsverlauf müssen bei der Entwicklung und Anwendung von immuntherapeutischen Interventionsstrategien bei der Hundestaupe berücksichtigt werden.
(virale Onkolyse).
CDV-infizierten Hunden untersucht. Die temporospatiale Phänotypisierung von Immunzellen mittels Immunhistochemie ergab eine vermehrte Anzahl an MHC-II+, Iba-1+ und CD204+ Zellen der angeborenen Immunantwort während der akuten und subakuten Phase der Infektion, die mit der höchsten Viruslast und den entzündlichen Veränderungen einhergingen. Die Anzahl der CD3+ T-Zellen war in infizierten Lungen erhöht. Die hohe CDV-Last und reduzierte Interleukin (IL)-2-Spiegel deuten allerdings auf eine funktionelle Beeinträchtigung der
T-Zellantwort während der akuten Phase der Infektion hin. Außerdem konnte eine Depletion von B-Zellen in der Frühphase der Infektion mit anschließender Repopulation in der subakut-chronischen Phase nachgewiesen werden. Globale Transkriptomanalysen mittels Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung (RNA-Seq) und RT-qPCR-Analysen des Lungengewebes akut CDV-infizierter Hunde zeigten eine Aufregulation pro-inflammatorischer Zytokine, wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin (IL)-6 und IL-12. Gleichzeitig waren Gene, die mit der Zilienfunktion und epithelialen Regeneration assoziiert sind (z. B. HOATZ, DNAI3, GDF5), in CDV-infizierten Lungen herunterreguliert. Darüber hinaus wiesen die RNA-Seq-Daten auf eine Aktivierung von apoptotischen Prozessen und der Typ-I-Interferon-Antwort hin. Diese Ergebnisse wurden mittels immunhistochemischer Quantifizierung von aktivierter Caspase-3 und Typ-I-Interferon-assozierten Proteinen (Mx-Protein, Protein-Kinase R, Interferon-stimuliertes Gen 15) bestätigt. Möglicherweise tragen die proinflammatorische Immunantwort und eine verminderte mukoziliäre Clearance während einer akuten CDV-Infektion sowohl zur Virusabwehr als auch zu immunvermittelten Gewebeschäden in der Lunge betroffener Hunde bei.
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