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Die Rolle der endothelialen Kandidatengene eif4ebp3l, matn-4 und prdx-1 in der Herzregeneration im Zebrabärbling-Modell

Der akute Myokardinfarkt zählt zu den häufigsten Todesursachen des Menschen weltweit. Seine Behandlung und die mit ihm verbundenen Spätfolgen, wie kardiale Arrhythmien und fortschreitendes Herzversagen führen zu einer immensen Belastung des Gesundheitssystems. Ursache für die Schwere der Erkrankung ist die beschränkte Regenerationskapazität des menschlichen Herzens. Dadurch erfolgt keine funktionelle Regeneration des geschädigten Myokards, sondern ein Ersatz durch bindegewebiges Narbengewebe mit einhergehendem Funktionsverlust. Ungeachtet des enormen medizinischen Fortschrittes der letzten Jahrzehnte, ist bislang nur eine symptomatische Therapie möglich und keine Behandlungsmethoden zur Induktion einer endogenen Regeneration verfügbar. Der Zebrabärbling (Danio rerio) hat sich aufgrund seiner hohen kardialen Regenerationsfähigkeit in den letzten Jahren als Tiermodell für kardiovaskuläre Pathologien etabliert. Zudem wurde mit der Kryoschädigung am Herzen (Cryoinjury) eine Methode entwickelt, die eine dem menschlichen akuten Myokardinfarkt vergleichbare Myokardschädigung im Zebrabärbling hervorruft. Im Gegensatz zum Menschen wird im Zebrabärbling über die Proliferation von prä-existenten Kardiomyozyten eine vollständige Regeneration des geschädigten Herzgewebes erreicht. Das geschädigte Herzgewebe wird durch funktionell intaktes, neues Myokard ersetzt, sodass die Ausbildung einer persistenten, bindegewebsreichen Narbe unterbleibt. Innerhalb der kardialen Regeneration kommt es zu einer Re-Expression von Genen der embryonalen Entwicklung des kardiovaskulären Systems des Zebrabärblings. Infolgedessen werden embryonale Signalwege in Kardiomyozyten und Endothelzellen reaktiviert und dadurch die Angiogenese sowie die Proliferation von Kardiomyozyten gefördert. Bisher konnte nur ein Teil der großen Anzahl an beteiligten Genen hinsichtlich ihrer Funktion und Rolle in der kardialen Regeneration Zusammenfassung 111 des Zebrabärblings definiert werden. Ziel des vorliegenden Dissertationsprojektes war es, die Rolle der endothelialen Kandidatengene eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 3-like (eif4ebp3l), matrilin-4 (matn-4) und peroxiredoxin-1 (prdx-1) in der Herzregeneration des Zebrabärblings zu charakterisieren. Das Zebrabärbling-Gen eif4ebp3l ist Mitglied der Familie der eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4E Bindungsproteine (4E-BPs) und ein Bestandteil der Regulation der Translation von mRNAs der Zellproliferation. Bislang ist die Rolle von eif4ebp3l nur im Kontext der aktivitätsabhängigen Myofibrillogenese beschrieben und nichts über den Einfluss von eif4ebp3l auf die proliferativen Prozesse der Herzregeneration bekannt. Das Ziel des ersten Teils der Arbeit (Manuskript und ergänzende Versuche) war es, die Rolle des Kandidatengens eif4ebp3l in der kardialen Regeneration und die Effekte seiner Überexpression auf die Regenerationsprozesse des Zebrabärblings zu beschreiben. Dazu wurde eif4ebp3l sowohl im Rahmen der embryonalen Angiogenese als auch im Rahmen der Herzregeneration nach Kryoschädigung von adulten Zebrabärblingen untersucht. Vorarbeiten zu einer Morpholino-induzierten Defizienz von eif4ebp3l in Zebrabärblingsembryonen zeigten, dass ein Fehlen von eif4ebp3l zu pro-angiogenen Effekten in Form von sprossender Angiogenese in der embryonalen Gefäßentwicklung führt. Zur Untersuchung von eif4ebp3l in der kardialen Regeneration wurden Zebrabärblingsherzen einer Kryoschädigung unterzogen und zu verschiedenen Zeitpunkten der Regeneration entnommen. Über in situ Hybridisierung erfolgte die Analyse des räumlichen und zeitlichen Expressionsmusters von eif4ebp3l sowie die Untersuchung zur Co-Lokalisation zu Endothelzellen. In der frühen Phase der Herzregeneration (Tag 1 bis 7) wies eif4ebp3l eine stark verminderte mRNAExpression im Infarktareal im Vergleich zum gesunden Myokard auf. In der späten Phase der Herzregeneration (ab Tag 21) erfolgte anschließend ein starker Anstieg der eif4ebp3l Expression im Infarktareal und eine deutliche Co-Expression zu Endothelzellen der border zone. Um in einem zweiten Schritt die Effekte einer Überexpression von eif4ebp3l auf die embryonale Angiogenese und kardiale Regeneration zu untersuchen, wurde eine transgene Zebrabärblingslinie mit hitzeschock-induzierbarer Überexpression von eif4ebp3l generiert. Zusammenfassung 112 Zebrabärblingsembryonen mit induzierter Überexpression zeigten deutlich erhöhte eif4ebp3l-mRNA-Level in der qRT-PCR, wiesen aber makroskopisch keine Veränderungen der Gefäßentwicklung auf. Überexpression von eif4ebp3l während der Herzregeneration führte zu verschiedenen Effekten im Verlauf der Herzregeneration. In der frühen Phase der Herzregeneration (Tag 7) wiesen Herzen mit eif4ebp3l Überexpression größere Infarktareale als Wildtypen auf und zeigten eine Beeinflussung der Kardiomyozytenproliferation. Im Gegensatz dazu führte eine Überexpression von eif4ebp3l zu späten Zeitpunkten der Herzregeneration (Tag 21 und 45) nur zu begrenzten Effekten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der Kandidatengene matn- 4 und prdx-1 in der Herzregeneration des Zebrabärblings. Die Untersuchung von matn-4 und prdx-1 in der kardialen Regeneration des Zebrabärblings erfolgte mittels in situ Hybridisierung auf Gefrierschnitten von kryogeschädigten Zebrabärblingsherzen an verschiedenen Zeitpunkten der Herzregeneration. Das Gen matn-4 codiert für ein nicht-kollagenes, extrazelluläres Matrixprotein, welches innerhalb der Extrazellularmatrix (EZM) als Adapterprotein fungiert. Die Erforschung der Matriline beschränkt sich bisher auf ihre Funktion in Knorpelgewebe. Ihre Rolle in der kardialen EZM und der Herzregeneration ist unbekannt. Matn-4 wies während der kardialen Regeneration des Zebrabärblings ein spezifisches Expressionsmuster mit wechselnder Co-Lokalisation zu Endothelzellen auf. Initial, in den ersten Tagen der Herzregeneration, zeigte matn-4 ähnlich wie eif4ebp3l eine starke Herabregulation der mRNA-Expression im Infarktareal. In diesem Zeitraum (Tag 1 bis 7) war keine deutliche Co-Lokalisation zu Endothelzellen ausgeprägt. Mit Beginn der reparativen Phase, ab Tag 7 der Herzregeneration, verstärkte sich die matn-4-Expression im Infarktareal. Es zeigte sich eine deutliche Co-Lokalisation zu Endothelzellen in der border zone und des sich regenerierenden Infarktareals. Das endotheliale Kandidatengen prdx-1 gehört hingegen zu der Enzymgruppe der Peroxidasen und ist Teil des zellulären antioxidativen Schutzsystems. Für Prdx-1 weisen verschiedene Modelle von kardiovaskulären Pathologien darauf hin, dass es bei erhöhtem oxidativem Stress vermehrt exprimiert wird und protektive Effekte auf Kardiomyozyten und Endothelzellen ausübt. Im Rahmen der Herzregeneration des Zusammenfassung 113 Zebrabärblings zeichnete sich für prdx-1 ein deutlich abweichendes Expressionsmuster zu der Expression von eif4ebp3l und matn-4 ab. Prdx-1 war in den ersten Tagen der kardialen Regeneration (Tag 1 bis 7) deutlich heraufreguliert und wies eine höhere mRNA-Expression im Infarktareal im Vergleich zum gesunden Myokard auf. Ferner erfolgte über diesen Zeitraum eine starke Co-Expression zu Endothelzellen der border zone. In der späten Phase der Regeneration verringerte sich die prdx-1 Expression im Infarktareal und gleichzeitig auch die Co-Expression zu Endothelzellen. Insgesamt bietet die vorliegende Arbeit neue Erkenntnisse bezüglich der Rolle der drei endothelialen Kandidatengene eif4ebp3l, matn-4 und prdx-1 in der kardialen Regeneration des Zebrabärblings. Alle drei Kandidatengene zeigten in Abhängigkeit zu den verschiedenen Phasen der Herzregeneration des Zebrabärblings und den damit verbundenen Regenerationsprozessen ein spezifisches Expressionsmuster und eine wechselnde Co-Lokalisation zu Endothelzellen. Eine Überexpression von eif4ebp3l beeinflusste vor allem die Mechanismen der frühen Phase der Herzregeneration und führte in der späten Phase der Regeneration nur zu begrenzten Effekten.

 

Acute myocardial infarction is one of the leading causes of human death worldwide. Its treatment and its associated late effects, such as cardiac arrhythmias and progressive heart failure, are an immense burden on the healthcare system. The limited capacity of the human heart mainly constitutes the severity of this disease. In fact, functional regeneration of the damaged myocardium is impossible, and it is only rudimentarily replaced by scar tissue formation, which is accompanied by a loss of function. Despite the enormous medical progress of the last decades, so far only symptomatic therapy is possible and treatment methods for the induction of endogenous regeneration are lacking. In recent years the zebrafish (Danio rerio) has been established as an animal model for cardiovascular pathologies due to its high cardiac regenerative capacity. In addition, cryoablation of the heart (cryoinjury) represents a method to mimic acute myocardial infarction of humans in zebrafish. In contrast to humans, complete regeneration of the damaged cardiac tissue by proliferation of pre-existing cardiomyocytes is possible in zebrafish. The damaged cardiac tissue is replaced by functionally intact myocardium, instead of the formation of a persistent, connective tissue-rich scar. During cardiac regeneration, re-expression of genes encoding for the embryonic development of zebrafish cardiovascular system occurs. Consequently, embryonic signalling pathways in cardiomyocytes and endothelial cells are reactivated, promoting angiogenesis and cardiomyocyte proliferation. So far, only a limited number of involved genes could be defined with respect to their function and role in zebrafish heart regeneration. The aim of the present project was to characterize the role of the endothelial candidate genes eukaryotic initiation factor 4E binding protein 3-like (eif4ebp3l), matrilin-4 (matn-4) and peroxiredoxin-1 (prdx-1) during zebrafish cardiac regeneration. Summary 115 The zebrafish gene eif4ebp3l is a member of the family of the eukaryotic translation initiation factor 4E binding proteins (4E-BPs) and an affector of translational regulation of cell proliferation mRNAs. To date, the role of eif4ebp3l has been described only in the context of activity-dependent myofibrillogenesis and nothing is known about the influence of eif4ebp3l on the proliferative processes of cardiac regeneration. The aim of the first part of this work (manuscript and supplemental experiments) was to describe the role of the candidate gene eif4ebp3l in zebrafish heart regeneration and effects of its overexpression on the regenerative processes. To this end, eif4ebp3l was studied in the context of embryonic angiogenesis and cardiac regeneration after cryoablation of adult zebrafish heart. Preliminary work on morpholino-induced knockdown of eif4ebp3l in zebrafish embryos showed that loss of eif4ebp3l leads to pro-angiogenic effects such as sprouting angiogenesis in embryonic vascular development. For investigation of eif4ebp3l in cardiac regeneration, zebrafish hearts were subjected to cryoablation and harvested at different time points during regeneration. In situ hybridization was used to analyze the spatial and temporal expression pattern of eif4ebp3l and to investigate co-localization to endothelial cells. In the early phase of cardiac regeneration (day 1 to 7), eif4ebp3l showed strongly reduced mRNA expression in the injured area compared to the healthy myocardium. Subsequently, in the late phase of cardiac regeneration (from day 21), there was a strong increase in eif4ebp3l expression in the injured area and further marked co-expression to endothelial cells of the border zone. In a second step, in order to investigate the effects of overexpression of eif4ebp3l on embryonic angiogenesis and cardiac regeneration, a transgenic zebrafish line with heat shock-inducible overexpression of eif4ebp3l was generated. Zebrafish embryos with induced overexpression showed markedly increased eif4ebp3l mRNA levels in qRT-PCR but did not show macroscopically changes in vascular development. Overexpression of eif4ebp3l during zebrafish heart regeneration resulted in various effects. In the early phase of cardiac regeneration (day 7), hearts with eif4ebp3l overexpression showed a larger size of the injured area than wild-type hearts. Furthermore, an altered cardiomyocyte proliferation was observed. However, day 21 and 45 after cryoinjury, overexpression of eif4ebp3l resulted merely in limited effects. Summary 116 The second part of this project focused on the role of the candidate genes matn-4 and prdx-1 in zebrafish heart regeneration. The study of matn-4 and prdx-1 in zebrafish cardiac regeneration was performed by in situ hybridizations on frozen sections of cryoablated zebrafish hearts at different time points of cardiac regeneration. The gene matn-4 encodes for a non-collagenous extracellular matrix protein that functions as an adaptor protein within the extracellular matrix (ECM). Research on matrilins has been limited to their function in cartilage tissue. Their role in cardiac ECM and heart regeneration is unknown. Matn-4 exhibited a specific expression pattern with alternating co-localization to endothelial cells during zebrafish heart regeneration. Initially, during the first days of cardiac regeneration, matn-4 showed a strong downregulation of mRNA expression in the injured area, similar to the expression of eif4ebp3l. During this period (day 1 to 7), no distinct co-localization to endothelial cells was expressed. Along with the onset of the reparative phase, from day 7 of cardiac regeneration, matn-4 expression increased in the injured area. There was a strong colocalization to endothelial cells of the border zone and of the regenerating injured area. In contrast, the endothelial candidate gene prdx-1 belongs to the enzyme group of peroxidases and is part of the cellular antioxidant protection system. For Prdx-1, various models of cardiovascular pathologies indicate that it is highly expressed during increased oxidative stress and exerts protective effects on cardiomyocytes and endothelial cells. In the context of zebrafish cardiac regeneration, a markedly divergent expression pattern to that of eif4ebp3l and matn-4 emerged for prdx-1. Prdx-1 was strongly upregulated during the first days of cardiac regeneration (days 1 to 7) and exhibited higher mRNA expression in the injured area compared with healthy myocardium. Furthermore, there was a strong co-expression to endothelial cells of the border zone. In the late phase of regeneration, prdx-1 expression in the injured area and co-expression to endothelial cells decreased. Overall, the present work provides new insights regarding the role of the three endothelial candidate genes eif4ebp3l, matn-4, and prdx-1 in zebrafish heart regeneration. Specific expression patterns and alternating co-localization to endothelial cells in relation to the different phases of zebrafish cardiac regeneration and the associated regenerative processes were identified. Overexpression of 117 eif4ebp3l mainly affected the mechanisms of the early phase of cardiac regeneration and resulted in limited effects in the late phase of regeneration.

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