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Glia during de-and remyelination

Focal lesions, astrogliosis, microglia activation and axonal loss in white and grey matter define demyelinating diseases of the central nervous system (CNS), such as multiple sclerosis (MS). Therefore, disease progression leads to neuronal damage-associated disability to different degrees in patients. To assess the pathology and therapeutic avenues of intervention, several animal models of de- and remyelination have been established. Therapeutic approaches conventionally aim to target autoreactive lymphocytes that infiltrate from the periphery through the blood-brain-barrier and mediate serious damage to CNS- resident glia populations and neurons. However, in recent decades, glia themselves, namely microglia, oligodendrocytes and astrocytes have become the focus of research due to their versatile functions. Study and modulation of glia during de- and remyelination therefore is of importance to exploit their full potential for future treatment options. 

In the first study, the after the establishment of the state-of-the-art RiboTag technology for selective labelling of cell-specific ribosome-associated mRNA demonstrates astrocyte plasticity during stages of de- and remyelination in the toxicity-mediated cuprizone model for de- and remyelination investigations. The region-specific approach for GFAP-expressing cells in white matter not only provided further insight into astroglial contribution to demyelination-linked pathogenesis but also revealed transcriptional regulatory mechanisms during remyelination to drive tissue regeneration. In particular, we elaborated translatomic astroglial signatures associated with leukocyte migration as well as cytokine- and chemokine production (CXCL10) during severe demyelination of the corpus callosum (CC). In addition, we highlighted by in silico receptor-ligand -interaction predictions that attributes during demyelination are mediated in crosstalk with microglia to aid a positive feedback loop of recruitment, inflammation and phagocytosis. Interestingly, we revealed by transcription factor enrichment analysis that both demyelination and remyelination processes are orchestrated by a distinct set of upstream regulators from Stat and Bmp-Runx-Smad family members. Moreover, we elucidate astrocytes to be relevant for both the onset and successful continued regeneration evident by signature comparison between early and late remyelination. Exemplary, we validated osteopontin (SPP1) to be elevated during early remyelination to presumably drive the differentiation of OPCs and dampen the inflammation. Furthermore, we demonstrate the presumed suppression of lymphocyte migration and activation while astrocytes actively promote glial cell differentiation, regeneration and tissue homeostasis. Therefore, we suggest a beneficial role of astrocytes in orchestrating tissue repair. 

In the second study, we investigated the off-target effects of Teriflunomide (TF), the active component in Relapse-remitting MS prescription drug (Aubagio®). While administration of Teriflunomide has been proven to be effective in the therapy of MS by inhibiting the proliferation of activated lymphocytes by the selective inhibition of the enzyme hihydrooroate dehydrogenase (DHODH), we here focused on its potential impact on glia. We therefore developed an in vitro model of de- and remyelination featuring lysophosphatidylcholine (LPC) as a toxic initiator of demyelination in organotypic slice culture (OSC) of murine cerebellum. 

Interestingly, immunohistochemistry showed reduced myelin degradation upon simultaneous treatment of 25 μM TF and LPC treatment of cultured cerebellar slices. In contrast, neither effect on developmental myelination nor spontaneous remyelination was evident. The myelin preservation effect of TF on ultrastructural level was further validated by electron microscopy. In OSCs, the preservation was accompanied by proliferation inhibition of polarized microglia, suggesting a lack of myelin debris removal by phagocytosis. However, this indirect effect of TF could not be replicated in vitro using primary glia cultures. Neither was there a cytotoxic nor cytoprotective effect on oligodendrocytes or astrocytes, suggesting an indirect complex but not yet understood mechanism of TF to protect against the onset of demyelination. 

The third study utilized the previously established OSC model to elucidate the effect of drug-based manipulation on microglia to promote remyelination. In this context, OSCs were stimulated with polysialic acid (polySia), a unique α-2,8-linked homopolymer of N-acetylneuraminic acid found as a posttranslational modification of the neural cell adhesion molecule. Microglia endogenously produce polySia upon in vitro LPS-stimulation. Here, we demonstrate that exogenously applied polySia has a critical degree of polymerization (DP) of 24 repeating units of sialic acid to attenuate the pro-inflammatory microglial response in vitro. Using two pools polySia, DP24-30 and DP8-14, we documented that DP24-30 significantly increased the remyelination rate of cerebellar white matter when administrated in remyelination. PolySia DP8-14 however is not recognized by Siglec-E and fails to exhibit regenerative features. Complementary, the tissue repair effect mediated by DP24-30 correlated with microglia that express arginase-1 and decrease the nitrite production. We determined these effects to be Siglec-E-dependent by using knockout mice. To conclude, we postulate polySia DP24-30 to be an effective modulator of cerebellar remyelination by anti-inflammatory Siglec-E dependent microglia. The precise characterization of the immune-balanced environment is the subject of future in vivo studies. 

Taken together, this thesis provides insights into the complex and time-dependent orchestration of glial cells during de- and remyelination, their relevance for remyelination outcome and their possibility as therapeutic targets. 

Demyelinisierungserkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), wie beispielsweise die Multiple Sklerose (MS) sind durch fokale Läsionen, Astrogliose, Aktivierung von Mikroglia und axonalen Verlust in weißer und grauer Substanz gekennzeichnet. Das Fortschreiten der Krankheit führt bei Patienten zu neuronalen Schäden und verbundener Behinderung in unterschiedlichem Ausmaß. Um die zugrundeliegende Pathologie und therapeutische Eingriffsmöglichkeiten zu untersuchen, wurden mehrere Tiermodelle der De- und Remyelinisierung etabliert. Konventionelle therapeutische Ansätze zielen darauf ab, autoreaktive Lymphozyten anzugreifen, die von der Peripherie durch die Blut-Hirn-Schranke infiltrieren und ernsthafte Schäden an ZNS-residenten Gliapopulationen und Neuronen 
vermitteln. In den letzten Jahrzehnten sind jedoch Gliazellen selbst, nämlich Mikroglia, Oligodendrozyten und Astrozyten, aufgrund ihrer vielseitigen Funktionen in den Fokus der Forschung gerückt. Die Untersuchung und Modulation von Glia während der De- und Remyelinisierung ist daher von Bedeutung, um das volle Potenzial für zukünftige Behandlungsoptionen auszuschöpfen. 
In der ersten Studie wird nach der Etablierung die hochmodernen RiboTag-Technologie zur selektiven Markierung von zellspezifischer Ribosomen-assoziierter mRNA dazu genutzt, um die Plastizität von Astrozyten während der Stadien der De- und Remyelinisierung im Toxizitäts- vermittelten Cuprizon-Modell zu untersuchen. Der regionsspezifische Ansatz für GFAP- exprimierende Zellen in der weißen Substanz lieferte nicht nur einen tieferen Einblick in den astroglialen Beitrag zur Demyelinisierungs-assoziierten Pathogenese, sondern enthüllte auch 
transkriptionale Regulationsmechanismen während der Remyelinisierung um die 
Regeneration des Gewebes voranzutreiben. Insbesondere wurden Astroglia-Signaturen im Zusammenhang mit Leukozytenmigration, sowie Zytokin- und Chemokinproduktion (CXCL10) während der späten Demyelinisierung des corpus callosum (CC) entdeckt. Darüber hinaus haben wir durch In-silico-Vorhersagen zur Rezeptor-Liganden-Interaktion ermittelt, dass die Attribute während der Demyelinisierung in Crosstalk mit Mikroglia vermittelt werden könnten, 
um eine positive Rückkopplungsschleife von Rekrutierung, Entzündung und Phagozytose zu unterstützen. Interessanterweise haben wir durch eine Transkriptionsfaktor- Anreicherungsanalyse herausgefunden, dass sowohl Demyelinisierungs- als auch Remyelinisierungsprozesse von einem bestimmten Satz transkriptioneller Regulatoren aus den Mitgliedern der Stat- und Bmp-Runx-Smad-Familie orchestriert werden. Darüber hinaus zeigen wir, dass Astrozyten sowohl für den Beginn als auch für die erfolgreich fortgesetzte Regeneration relevant sind, was durch Vergleich der translatomische Signaturen zwischen 
früher und später Remyelinisierung ersichtlich wird. Exemplarisch validierten wir, dass Osteopontin (SPP1) während der frühen Remyelinisierung erhöht ist, vermutlich um die Differenzierung von OPCs voranzutreiben und die Entzündung zu dämpfen. Darüber hinaus fanden wir die vermeintliche Unterdrückung der Lymphozytenmigration und -aktivierung, während Astrozyten aktiv die Differenzierung, Regeneration und Gewebehomöostase der Gliazellen fördern. Daher schlagen wir eine vorteilhafte Rolle der Astrozyten bei der 
Orchestrierung der Gewebereparatur vor. 
In der zweiten Studie untersuchten wir die Off-Target-Effekte von Teriflunomid (TF), dem Wirkstoff des verschreibungspflichtigen Medikaments (Aubagio®) für schubförmige MS. Während sich die Verabreichung von Teriflunomid bei der Therapie von MS durch die Hemmung der Proliferation aktivierter Lymphozyten durch die selektive Hemmung des Enzyms Hihydrooroat-Dehydrogenase (DHODH) als wirksam erwiesen hat, konzentrierten wir uns hier auf seine potenzielle Wirkung auf Glia. Wir haben daher ein In-vitro-Modell der De- und Remyelinisierung mit Lysophosphatidylcholin (LPC) als toxischem Initiator der Demyelinisierung in zerebellaren organotypischen Schnittkulturen (OSC) von murinem 
Kleinhirn entwickelt. Interessanterweise zeigte die Immunhistochemie einen verringerten Myelin Abbau bei gleichzeitiger Behandlung mit 25 μM TF und LPC auf kultivierten Kleinhirnschnitten. Im Gegensatz dazu war weder eine Wirkung auf die 
Entwicklungsmyelinisierung noch auf die spontane Remyelinisierung bemerkbar. Die Myelin-erhaltende Wirkung von TF auf ultrastruktureller Ebene wurde des Weiteren durch Elektronenmikroskopie validiert. Bei den OSCs wurde die Erhaltung des vorhandenen Myelins von einer Proliferationshemmung polarisierter Mikroglia begleitet, was auf eine fehlende Entfernung des degradierten Myelins durch Phagozytose hindeutet. Dieser indirekte Effekt von TF konnte jedoch nicht in vitro mittels Verwendung von primären Glia-Kulturen repliziert werden. Weder gab es eine zytotoxische noch protektive Wirkung auf Oligodendrozyten oder 
Astrozyten, was auf einen indirekten komplexen, aber noch nicht verstandenen Mechanismus von TF zum Schutz vor dem Einsetzen der Demyelinisierung hindeutet. 
Die dritte Studie verwendete das zuvor etablierte OSC-Modell, um die Effekte einer 
wirkstoffbasierten Manipulation der Mikroglia zur Förderung der Remyelinisierung zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurden OSCs mit Polysialinsäure (polySia), einem einzigartigen α-2,8-verknüpften Homopolymer der N-Acetylneuraminsäure behandelt, das als posttranslationale Modifikation des Zelladhäsionsmoleküls bekannt ist. Mikroglia produzieren polySia endogen in einer Rückkopplungsschleife der inflammatorischen Aktivierung nach in vitro LPS-Stimulation. Hier zeigen wir, dass exogen verabreichtes polySia nach LPS- 
Stimulation einen kritischen Polymerisationsgrad (DP) der polySia bei 24 sich wiederholenden Einheiten von Sialinsäure hat, der in der Lage ist, die Mikroglia-Reaktion in vitro abzuschwächen. Unter Verwendung von zwei polySia-Pools, DP24-30 und DP8-14, beobachteten wir, dass die lange polySia-Kettenlänge von Kohlenhydrat-Homopolymeren die Remyelinisierungsrate der weißen Substanz des Kleinhirns nach exogener Behandlung mit polySia DP24-30 während der Remyelinisierung signifikant erhöhte. PolySia in DP8-14 wird 
jedoch von Siglec-E nicht erkannt und weist keine regenerativen Eigenschaften auf. Ergänzend fanden wir Hinweise für den durch 24-30DP vermittelte Gewebereparatureffekt der Mikroglia, veranschaulicht durch die Expression von Arginase-1 und eine verringerte Nitrit Produktion. Wir haben diese Effekte als Siglec-E-abhängig validiert, indem wir Knockout- Mäuse verwendet haben. Abschließend postulieren wir, dass polySia DP24-30 ein wirksamer 
Modulator der zerebellären Remyelinisierung durch entzündungshemmenden Siglec-E- abhängigen Mikroglia ist. Die genaue Charakterisierung der immun-modulierten Gewebeumgebung ist Gegenstand zukünftiger In-vivo-Studien. 
Zusammenfassend bietet diese Arbeit Einblicke in die komplexe und zeitabhängige Orchestrierung von Gliazellen während der De- und Remyelinisierung, ihre Relevanz für die Remyelinisierung und ihre Möglichkeit als therapeutische Ziel. 

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