Auswirkungen des Sertoli-Zell-spezifischen Verlusts des Gap-Junction-Proteins Connexin 43 auf die Zellgestalt und das Zytoskelett von Sertoli-Zellen

Ueffing, Mareike

Dissertation 2023 CC BY-NC-ND 4.0

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Auswirkungen des Sertoli-Zell-spezifischen Verlusts des Gap-Junction-Proteins Connexin 43 auf die Zellgestalt und das Zytoskelett von Sertoli-Zellen

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Eine Möglichkeit genetisch bedingte Einflüsse auf die Spermatogenese zu verstehen, stellen Knockoutmodelle dar. Der konditionale Knockout von Connexin 43 in murinen Sertoli-Zellen (SCCx43KO^-/-) führt zu einem Arrest der Spermatogenese auf Stufe der Spermatogonien oder einem SCO-Syndrom. Ferner zeichnen sich die Tubuli seminiferi der SCCx43KO^-/--Mäuse durch einen geringeren Durchmesser, Vakuolen und intratubuläre Zellagglomerate aus. Die Ursache für den veränderten Phänotyp ist bislang nicht hinreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit war die Betrachtung der Zellgestalt und des Zytoskeletts von Sertoli-Zellen der SCCx43KO^-/--Mäuse im Vergleich zu den Sertoli-Zellen ihrer Wildtypwurfgeschwister.

Die Zellgestalt wurde sowohl 2-dimensional mithilfe eines Transelektronenmikroskops (TEM) als auch 3-dimensional durch Rekonstruktion von - mittels eines Serienschnitt-Rasterelektronenmikroskops untersuchten - Gewebeblöcken analysiert. Während Wildtyp-Sertoli-Zellen eine baumstammartige Gestalt aufwiesen, waren die mutierten Sertoli-Zellen polymorph. Sie glichen seltsamen, unsymmetrischen Sternen, wiesen eine wellenartige Form auf oder waren bauchig aufgetrieben und enthielten große Vakuolen in ihrem Zytoplasma.

Das Zytoskelett - bestehend aus Mikrotubuli, Aktin- und Intermediärfilamenten - wurde vergleichend in SCCx43KO^-/-- und Wildtypmäusen mittels Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, TEM und Immunelektronenmikroskopie untersucht.

Sowohl immunhistochemisch als auch transelektronenmikroskopisch zeigte sich, dass polymerisierte Mikrotubuli in SCCx43KO^-/--Sertoli-Zellen vorhanden waren. Diese waren allerdings nicht wie bei den Wildttyptieren gerade zum Lumen hin ausgerichtet, sondern folgten der abnormalen Sertoli-Zellgestalt.

Aktinfilamente, als Teil der apikalen und basalen Ektoplasmatischen Spezialisierungen (ES) der Sertoli-Zelle, wiesen bei Sertoli-Zellen ohne Cx43 ebenfalls Veränderungen auf. Apikale ES waren nicht ausgebildet. Basale ES waren morphologisch intakt, allerdings in viel größerem Ausmaß ausgebildet als bei Wildtypmäusen.

Sertoli-Zellen beider Genotypen färbten sich immunopositiv für Vimentin, dem in Sertoli-Zellen vorherrschenden Intermediärfilament, an. Keine positive Färbung ließ sich dagegen mit Antikörpern gerichtet gegen Keratine hervorrufen.

Folglich korreliert der Verlust von Cx43 in Sertoli-Zellen mit Veränderungen der Zellgestalt und der Mikrotubuli- und Aktinfilamentdistribution. Ein Einfluss auf Intermediärfilamentsynthese oder –distribution ist vernachlässigbar gering.

Knockout mouse models may lead to a better understanding of genetic influences on spermatogenesis. The Sertoli cell specific loss of Connexin 43 (Cx43) in mice leads to an arrest of spermatogenesis at the level of spermatogonia or a Sertoli cell only syndrome. Furthermore, the seminiferous epithelium exhibits intratubular cell clusters and vacuoles. The underlying root cause for this altered histological phenotype is not fully decoded yet. The study at hand was supposed to shed light on an explanatory approach that so far had been ignored: the impact of Cx43 on the cell shape and the cytoskeleton of SCCx43KO^-/--Sertoli cells.

The Sertoli cell shape was investigated 2-dimensionally via transmission electron microscopy as well as 3-dimensionally using serial block-face scanning electron microscopy images for 3D-reconstruction. While wild type Sertoli cells appeared stem-like, SCCx43KO^-/--Sertoli cells were polymorphic. They resembled deflated, soggy balloons, weird star-like structures or waves. Others were bulged and beaten due to large vacuoles within their cytoplasm.

Using immunohistochemistry, immunofluorescence, transelectron microscopy and immune electron microscopy the cytoskeletal components (intermediate filaments, actin filaments and intermediate filaments) were investigated in view of their spatial organisation.

Transmission electron microscopy imaging revealed that SCCx43KO^-/--Sertoli cells feature polymerised microtubules, but those were not oriented towards the lumen as observed in wild type Sertoli cells. Rather, they followed the abnormal cell shape of the mutant Sertoli cells.

Actin-filaments, as part of apical and basal ectoplasmic specialisations, differed in Cx43 deficient Sertoli cells as well. Due to the absence of spermatids, mutant Sertoli cells did not feature apical ectoplasmic specialisations. Nevertheless, basal ectoplasmic specialisations appeared to be intact and even increased in number and spatial extension.

Lastly, Sertoli cells of both genotypes immunostained positive for vimentin, the prevalent intermediate filament of Sertoli cells, but not for keratins.

Hence, Cx43 deficiency in Sertoli cells correlates not only with severe Sertoli cell shape alterations but also with changes in microtubule and actin filament distribution while intermediate filament synthesis seems to be only negligibly influenced.